1. Detect de absorbance fan RNA oplossing
Absorbânsje by 280, 320, 230 en 260 nm fertsjintwurdiget respektivelik de wearden fan nukleïnesûr, eftergrûn (oplossing turbiditeit), sâltkonsintraasje, en organysk materiaal lykas proteïne.Algemien allinne sjen op OD260 / OD280 (Ratio, R).As 1.8 ~ 2.0, tinke wy dat de fersmoarging fan proteïne of oare organyske stof yn RNA tolerearre wurde kin, mar it moat opmurken wurde dat as Tris brûkt wurdt as de buffer om de absorbinsje te detektearjen, kin de R-wearde grutter wêze as 2 (algemien moat it <2.2 wêze).As R<1.8, is de fersmoarging fan proteïne of oare organyske stof yn 'e oplossing dúdliker, en it lot fan' e RNA kin bepaald wurde neffens de behoeften.As R>2.2, betsjut it dat RNA is hydrolysearre yn ien nucleic acid.
2.Electrophoretic patroan fan RNA
Algemien wurdt denaturearjende gel brûkt foar RNA-elektroforese, mar as it allinich is foar it opspoaren fan 'e kwaliteit fan RNA, is denaturearjende gel net nedich, en gewoane agarosegel kin brûkt wurde.It doel fan elektroforese is om de yntegriteit fan 28S- en 18S-banden en har ferhâlding te detektearjen, as de yntegriteit fan mRNA-smear.Algemien, as de 28S en 18S bands binne helder, dúdlik en skerp (ferwizend nei de rânen fan de bands binne dúdlik), en de helderheid fan 28S is mear as twa kear dat fan de 18S band, wy beskôgje de kwaliteit fan de RNA te wêzen goed.
It boppesteande binne de twa metoaden dy't wy gewoanlik brûke, mar net ien fan dizze twa metoaden kin ús dúdlik fertelle oft d'r oerbleaune RNase is yn 'e RNA-oplossing.As d'r in heul lyts bedrach fan RNase yn 'e oplossing is, is it dreech foar ús om it te ûntdekken mei de boppesteande metoade, mar de measte folgjende enzymatyske reaksjes wurde útfierd op boppe 37 graden en foar in lange tiid.Op dizze manier, as d'r in heul lyts bedrach fan RNase yn 'e RNA-oplossing is, dan sil d'r in heul geskikte omjouwing en tiid wêze om har rol te spyljen yn' e folgjende eksperiminten, en fansels sil it eksperimint op dit stuit kâld wêze.Hjirûnder yntrodusearje wy in metoade dy't kin befestigje oft der oerbleaune RNase yn 'e RNA-oplossing is.
3. Heat behâld test
Neffens de stekproef konsintraasje, tekenje twa 1000 ng RNA út de RNA oplossing en heakje it oan in 0,5 ml centrifuge buis, en oanfolje it mei pH 7,0 Tris buffer nei in totaal folume fan 10 ul, en dan seal de kap fan 'e buis.Set ien fan harren yn in wetterbad mei konstante temperatuer op 70 ° C en hâld it waarm foar 1 h.It oare diel waard opslein yn in -20 ° C kuolkast foar 1 h.As de tiid op is, ferwiderje de twa monsters foar elektroforese.Nei't de elektroforese foltôge is, fergelykje de elektroforetyske bands fan 'e twa.As de bands fan de twa binne konsekwint of hawwe gjin signifikante ferskil (fansels, harren bands foldogge ek oan de betingsten yn metoade 2), it betsjut dat der gjin oerbleaune RNase fersmoarging yn de RNA oplossing, en de kwaliteit fan de RNA is hiel goed.Krektoarsom, as it stekproef ynkubeare by 70 ° C dúdlike degradaasje toant, jout it oan dat d'r RNase-fersmoarging is yn 'e RNA-oplossing.
2 Eksperimintele metoaden en techniken foar RNA-ekstraksje
De problemen dy't wy faak tsjinkomme by it ekstrahearjen fan RNA binne: (1) RNA-opbringst is leech;(2) RNA hat serieuze sâltfersmoarging;(3) RNA hat serieuze organyske solventfersmoarging;(4) sample degradaasje en oare problemen
1. Faak brûkte totale RNA ekstraksje reagents
De metoade fan guanidine-isothiocyanaat en de Trizol-metoade binne de meast brûkte metoaden foar de ekstraksje fan totaal RNA út dierlike weefsels en diersellen.It is benammen gaadlik foar lytse samples en weefsels dy't benammen dreech binne om te ekstrahearjen, lykas de winning fan totaal RNA út konijnhûd en bistebindeweefsel;boppedat, Trizol, as in algemien-doel lysis reagens, kin ek brûkt wurde foar de winning fan plant weefsels, baktearjes, fungi en oare weefsels.Foar plantweefsels dy't polysaccharides en polyfenolen befetsje, lykas camellia oleifera, teeblêden, raapsied, ensfh., kin de CTAB-metoade ek brûkt wurde om totaal RNA te ekstrahearjen.
As in konvinsjonele metoade is de metoade mei dûbele kolommen ek heul populêr fanwegen syn normale temperatueroperaasje, gjin needsaak om RNase ta te foegjen, en feiligens - gjin chloroform, fenolen en oare organyske reagentia foar ekstraksje.(oanrikkemandearre produkten )
2. Ekstraksje fan totale RNA út dierlike weefsels
(1) Besykje te kiezen farske weefsel, as it is net farsk (leafst binnen trije moannen - 80 ℃ kuolkast of beferzen yn floeibere stikstof. By cutting weefsel, net snije direkt by keamertemperatuer, wês wis te Set it op 'e iis doaze, besykje te kommen dat werhelle freezing en thawing.
(2) Brûk skjinne skjirre en pincet om in lyts stikje weefsel te snijen, besykje it sintrale diel fan it weefsel te snijen by it snijen fan 'e stekproef, of earst it grutte stik weefsel út' e midden ôfsnije, en dan snije de stekproef op 'e frisse incision posysje.It fuorthelle weefsel moat folslein fersnippere wurde, set it fersnippere weefsel yn in EP-buis sûnder RNase, foegje de lysate ta, it fersnippere weefsel moat folslein bleatsteld wurde oan it lysate, en tariede op homogenisaasje.
(3) Foar normale weefsels, selektearje mung bean-grutte weefsels (30-60 mg) foar homogenisaasje.As de weefsels in grutte hoemannichte proteïne, fet, of dichte fibrous weefsels lykas lever befetsje, passend ferheegje of ferminderje it bedrach fan snijde weefsels (opsjoneel) Kies 10 ~ 20 mg).
(4) As fisk spier, shrimp fleis, kwallen en oare weefsels mei hege wetter ynhâld wurde ekstrahearre, it sample folume moat passend wurde ferhege (oanrikkemandearre 100-200 mg).
(5) As betingsten it tastean, kin it dierweefsel direkt wurde ekstrahearre nei't se homogenisearre binne mei in homogenisator mei hege passaazje, as d'r gjin sa'n apparatuer is.
(6) De RNA krigen nei de definitive ekstraksje moat wurde pleatst op de iis doaze fuortendaliks te ferminderjen de degradaasje fan RNA.
3. Animal cell RNA ekstraksje
(1) Suspension sellen: centrifuge direkt en smyt it medium, waskje mei sterile PBS foar 1-2 kear, dan suspend mei in passend bedrach fan PBS, en dan foegjen lysate foar lysis.Foegje it lysate net direkt ta oan 'e precipitearre sellen nei't de flüssigens folslein ferwidere is.Dit sil feroarsaakje dat de histone pakket útbrocht nei de lysed sellen op 'e bûtenste laach te adhere oan' e bûtenkant fan 'e precipitated sellen, dêrmei beheine it kontakt fan de sellen binnen de pellet mei de lysate., wat resulteart yn ûnfolsleine sellysis en fermindere RNA-opbringst.
(2) Sellen dy't semi-adherent binne of net strak adherent: Nei it fuortheljen fan it medium, waskje mei PBS foar 1-2 kear, absorbearje dan direkt in passend bedrach fan PBS en blaze it kultuerskûtel mei in pipet of gewear om de sellen ôf te blazen, en oerdrage se nei RNA-frije sellen.Foegje de lysate ta oan 'e EP-buis fan it enzyme foar ekstraksje.
(3) Adherent sellen: moatte earst wurde digested mei trypsin, dan sammele yn RNase-frije EP buizen, centrifuged te ferwiderjen de supernatant, wosken 1-2 kear mei PBS te ferwiderjen oerstallige trypsin, en resuspended mei in passend bedrach fan PBS Dan gean nei de ekstraksje stap.
4. Plant RNA ekstraksje
Planteweefsels binne ryk oan fenolyske ferbiningen, of ryk oan polysaccharides, of befetsje wat ûnbekende sekundêre metaboliten, of hawwe hege aktiviteit fan RNase.Dizze stoffen wurde strak kombinearre mei RNA nei sel lysis te foarmjen ûnoplosbere kompleksen of kolloïdaal delslach, dy't dreech te ferwiderjen.Dêrom, as wy plantweefsel ekstrahearje, moatte wy in kit foar planten kieze.De lysate yn 'e kit kin effektyf oplosse de problemen fan maklike oksidaasje fan polyphenols en skieding fan polysaccharide ferbiningen en nucleic soeren.
(Foar polysaccharide polyphenol plant RNA ekstraksje, oanrikkemandearre produkten:
(1) De skelp, pulp, sied, blêden, ensfh.Tidens it slypproses moat floeibere stikstof op 'e tiid wurde oanfolle om it probleem te foarkommen.It grûnmonster moat fluch wurde tafoege oan it lysate en skodde om RNA-degradaasje te foarkommen.
(2) Foar fiber-rike samples lykas rys en tarwe blêden, it bedrach fan ekstraksje moat passend wurde fermindere, oars sil it weefsel slypjen en lysis net folslein, resultearret yn in lege opbringst fan extracted RNA.
(3) Foar plantweefsels mei hege wetterynhâld, lykas granaatappelfrucht, watermeloenfrucht, perzikfrucht, ensfh., De stekproefgrutte moat passend wurde ferhege (100-200 mg is opsjoneel).
(4) Planteweefsels, lykas plantblêden, rizomen, hurde fruchten en oare materialen wurde oer it algemien oanrikkemandearre om floeibere stikstof te brûken om de yngrediïnten yn in mortier yngeand te morteljen, en gean dan troch nei de ekstraksjestap.Konvinsjonele weefselhomogenisatoren binne miskien net effektyf yn homogenisearjen fan plantweefsels, en wurde oer it algemien net oan te rieden.
5. Foarsoarchsmaatregels foar RNA-ekstraksje
(1) Weefselmonsters moatte sa farsk mooglik wêze om werhelle befriezen en ûntdooien te foarkommen.
(2) It weefsel moat by ekstraksje folslein grûn wurde, en it bedrach fan weefsel moat net te min wêze, lit stean te folle.
(3) Genôch ynkubaasjetiid moat wurde jûn nei it tafoegjen fan it lysate om it monster folslein te lysearjen.
(4) By it brûken fan de Trizol-metoade foar ekstraksje, is it prinsipe fan it absorbearjen fan de supernatant nei stratifikaasje "leafst minder ynhale dan mear ynhale", en moat net ekstrahearje nei de middelste laach, oars sil it serieuze genomyske DNA-fersmoarging feroarsaakje.
(5) By it waskjen moat de waskflüssigens folslein om 'e buismuorre hinne ynfiltrearje om deeglike waskjen te garandearjen.
(6) Foar de kolomekstraksjemetoade, neist it losmeitsjen fan de kolom nei it wassen, moat de adsorpsjekolom ek yn in ultra-skjinne bank pleatst wurde en 5-10 minuten blaasd wurde om it organyske solvent folslein te ferdampen oant droech.
(7) By de lêste eluaasje fan 'e kolommetoade, nei it tafoegjen fan DEPC-wetter, moat it 3-5 minuten ynkubeare wurde, of it DEPC-wetter moat fan tefoaren oant 60 ° C wurde ferwaarme om de elueringsopbringst te ferheegjen.Yn 'e tradysjonele Trizol-spalt- en isopropanol-ôfslachmetoade wurdt it definitive RNA yn DEPC-wetter oplost, sadat in passende tiid moat wurde jûn foar ûntbining, en de boaiem fan' e sintrifugebuis moat kontinu blaasd wurde mei in pipetpunt.
3 Three oarsaken en oplossings foar lege RNA konsintraasje / min kwaliteit
1. De opbringst is te leech
It extracted sample is te leech, it totale bedrach is net genôch, of it extracted sample is te folle en de lysis is net folslein;it weefsel of sellen fan passende kwaliteit moatte brûkt wurde foar ekstraksje, de foarbehanneling fan it stekproef moat goed dien wurde, en de lysis moat genôch wêze.
2. Genome resten
By it ekstrahearjen troch Trizol-metoade, as de supernatant nei it lagen yn 'e middelste laach wurdt sûge, sil serieuze genoomfersmoarging wurde feroarsake;ekstra foarsichtigens moat nommen wurde by it lizzen om te foarkommen dat it yn 'e middenlaach sûgje.As de kolommetoade wurdt brûkt foar ekstraksje, kin in kit mei DNase I selektearre wurde foar ekstraksje.It nukleïnesûr dat op it membraan is geadsorbeerd, wurdt direkt ferwurke mei DNase I, wat DNA-residuen sterk kin ferminderje.
3. RNA ôfbraak
It kin wêze de degradaasje fan it ekstrahearre stekproef sels, of de degradaasje feroarsake tidens it ekstraksjeproses;sa fier mooglik, frisse samples moatte brûkt wurde foar RNA-ekstraksje, en de sammele monsters moatte wurde opslein yn floeibere stikstof of -80 ° C kuolkast yn 'e tiid, en werhelle freezing en thawing moatte wurde mijd.RNase / DNase-frije tips, sintrifugebuizen en oare materialen moatte wurde brûkt yn it RNA-ekstraksjeproses.It ekstraksjeproses moat sa rap mooglik wêze.De ekstrahearre RNA moat wurde pleatst op in iis doaze en opslein op -80 yn 'e tiid.As de ekstrahearre RNA moat wurde ûntdutsen troch gel electrophoresis, electrophoresis moat wurde útfierd fuortendaliks nei ekstraksje, en de electrophoresis buffer moat wurde ferfongen troch in nij taret ien.
4. Sâlt en organyske solventresten
De ekstraksjereagens befetsje fenol en guanidine sâlten, en de waskoplossing befettet ethanol.Tidens de winning proses, de lysate waard net hielendal opnomd en ôffierd, en de wask oplossing waard net folslein droech.Residuele sâlten en organyske solvents binne skealik foar folgjende reverse transkripsje en PCR.Ferskillende graden fan remming, sadat it weefsel lysate folslein fuortsmiten wurde yn 'e ekstraksjeproses, en it waskjen moat genôch wêze sadat de omlizzende muorren fan' e buis kinne wurde wosken.Dêrnjonken wurdt de buis leech en blaasd is in needsaaklike stap, dy't it oerbliuwsel fan organyske stof fierder sil ferminderje.
Foar mear ynformaasje oer RNA-ekstraksje, folgje asjebleaft ús webside:
www.foreivd.com foar mear ynformaasje.
Post tiid: Dec-01-2022
