PCR, meardere PCR, Yn situ PCR, Omkearde PCR, RT-PCR, qPCR (1)-PCR

Wy sille de begripen, stappen en details fan ferskate PCR sortearje

Ⅰ. PCR

Polymerase Chain Reaction, oantsjutten as PCR, is in molekulêre biologyske technology dy't brûkt wurdt om spesifike DNA-fragminten te fergrutsjen.It kin wurde beskôge as in spesjale DNA-replikaasje in vitro.DNA polymerase (DNA Polymerase I) waard ûntdutsen al yn 1955, en Klenow Fragmint fan E. Coli, dat hat eksperimintele wearde en praktykanalyses, waard ûntdutsen troch Dr. H. Klenow yn de iere jierren 1970, mar om't dit enzyme net ferneare temperatuer, hege temperatuer kin degenerearje it, sadat it net foldocht oan de hege temperatuer keten degeneraasje reaksje.De enzymen dy't hjoeddedei brûkt wurde (neamd Taq polymerase), waarden isolearre út Thermus aquaticus, in hjitteboarnebaktearje yn 1976. It skaaimerk dêrfan is dat it tsjin hege temperatueren wjerstean kin en in ideaal enzym is, mar it wurdt nei de jierren '80 in soad brûkt.It orizjinele konsept fan it orizjinele primitive prototype fan PCR is fergelykber mei genreparaasje en kopiearjen, dat waard foarsteld troch Dr KJell Kleppe yn 1971. Hy publisearre de earste ienfâldige en koarte-termyn gene-kopy (lykas de earste twa syklusreaksjes fan PCR).De PCR ûntwikkele hjoed waard ûntwikkele troch Dr.. Kary B. Mullis yn 1983. Dr.. Mullis tsjinne PE bedriuwen dat jier, sadat PE hat in spesjale status yn de PCR yndustry.Dr Mullis publisearre offisjeel it earste relatearre papier mei Saiki en oaren yn 1985. Sûnt dy tiid is it gebrûk fan PCR tûzenen milen deis, en de kwaliteit fan relatearre papieren kin sein wurde dat in protte oare ûndersyksmetoaden ûngemaklik meitsje.Ferfolgens wurdt PCR-technology in protte brûkt yn biologysk wittenskiplik ûndersyk en klinyske tapassingen, en wurdt de wichtichste technology fan molekulêre biologyûndersyk.Mullis wûn ek de Nobelpriis foar Skiekunde yn 1993.

PCRPrinsipe

It basisprinsipe fan PCR-technology is fergelykber mei it natuerlike replikaasjeproses fan DNA, en har spesifisiteit hinget ôf fan 'e oligonucleotide-primer dy't komplementêr is oan beide einen fan' e doelsekwinsje.PCR is gearstald út degeneraasje-annealing-útwreidzjen fan trije basisreaksjestappen: ①Degeneraasje fan template DNA: Nei't de template DNA wurdt ferwaarme oant likernôch 93 ° C foar in bepaalde perioade fan tiid, de dûbele DNA oplossing foar de dual-chain DNA foarme troch de PCR amplification fan it template DNA Leaving, meitsje it in inkele ketting foar de folgjende keatling te kombinearjen foar de folgjende keatling.②De annealing (ferbân) fan it sjabloan-DNA en de primer: Nei't it sjabloan-DNA wurdt ferwaarme en degenerearre yn in inkele keten, sakket de temperatuer nei sawat 55 ° C.De komplemintêre folchoarder fan 'e primer en it sjabloan DNA single-chain.③De útwreiding fan 'e primer: DNA-sjabloan - de primerbinding is basearre op' e aksje fan TaqDNA-polymerase, mei dNTP as it reaksjegrûnmateriaal.Hâld it prinsipe fan replikaasje, synthesize in nij semi-reservearre kopy ketting dy't oanfolling op de sjabloan DNA keten, en werhelje syklus degeneraasje-annealing-útwreiding trije prosessen kinne krije mear "semi-reservearre kopy ketting", en dizze nije ketting is beskikber wer Become in sjabloan foar de folgjende syklus.It duorret 2-4min om de loop te foltôgjen, it doelgen kin ferskate miljoen kear yn 2-3 oeren fersterke wurde.

StandertPCRReaksje Systeem

Fiif eleminten fan PCR-reaksje

D'r binne benammen fiif soarten stoffen belutsen by PCR-reaksje, nammentlik primer, enzyme, dNTP, sjabloan en buffer (Mg2+ is fereaske).[PCR-proseduere]

It standert PCR-proses is ferdield yn trije stappen

1. DNA degeneraasje (90 ° C-96 ° C): Dual-chain DNA sjabloanen ûnder termyske aksje, wetterstof obligaasjes brekke, it foarmjen fan in single-chain DNA.

2. Annealing (25 ℃ -65 ℃): De systeemtemperatuer wurdt fermindere, de primer wurdt kombinearre mei it DNA-sjabloan om in lokale dual-chain te foarmjen.

3. Utwreiding (70 ℃ -75 ℃): Under de aksje fan Taq-enzyme (sawat 72 ° C, de bêste aktiviteit), wurdt dNTP brûkt as it grûnstof, útwreidzje fan 'e 5'-ein fan 'e primer → 3'-ein, synteze en sjabloan komplementearje elkoar DNA-keten.

Elke syklus wurdt denaturearre, annealed en útwreide, ferdûbeling fan de DNA-ynhâld.Op it stuit, troch it koarte amplifikaasjegebiet, kin guon PCR yn in heul koarte tiid replikearre wurde, sels as de Taq-enzymeaktiviteit net optimaal is, dus kin it feroare wurde yn twa stappen, dat is, de annealing en útwreiding kinne tagelyk útfierd wurde op 60 ° C-65 ° C.Om it proses fan opheffen en koeljen te ferminderjen en de reaksjesnelheid te ferbetterjen.

PCR Reaction funksjes

● Hege spesifisiteit

De spesifike beslissende faktoaren fan 'e PCR-antwurd binne: ①De spesifike kombinaasje fan 'e primer en it sjabloan DNA.②It prinsipe fan basisparing.③De loyaliteit fan 'e TaqDNA-polymerase-synthese-reaksje.④De spesifisiteit en konservativiteit fan it doelgen.

De juste kombinaasje fan primers en sjabloanen is de kaai.De bining fan 'e primer en it sjabloan en de útwreiding fan' e primerketen binne basearre op it prinsipe fan alkaline-base-oerienkomst.De loyaliteit fan polymerase-synteze-reaksjes en de hege temperatuerresistinsje fan 'e Taq DNA-polymerase om de bining (ferbining) fan' e sjabloan en primer yn 'e reaksje te meitsjen kinne wurde útfierd op in hegere temperatuer.De spesifisiteit fan 'e kombinaasje is sterk ferhege.De klip kin in hege graad fan korrektheid behâlde.Troch in doelgenetyske regio te selektearjen mei hege konservativiteit en hege konservativiteit, is har spesifisiteit heger.

● Hege gefoelichheid

De produksje folume fan PCR produkten wurdt ferhege troch yndeks, dat kin útwreidzje de start sjabloan fan Picker (PG = 10-12) te fergrutsjen it nivo fan microcontroller nei it nivo fan micrograms (μg = -6).In doelsellen kinne wurde ûntdutsen út 1 miljoen sellen;by it opspoaren fan firussen kin de gefoelichheid fan PCR 3 RFU's berikke (lege plakken foarme ienheden);it minimale opspoaringsnivo yn baktearjewittenskip is 3 baktearjes.

● Ienfâldich en fluch

De PCR-refleksje brûkt in hege temperatuer Taq DNA-polymerase, dy't de reaksje-oplossing tagelyk tafoeget, dat is, in degeneraasje-anneal-útwreidingsreaksje op 'e DNA-amplifikaasjeoplossing en wetterbadpot.Yn 't algemien wurdt de amplifikaasjereaksje yn 2 oant 4 oeren foltôge.Fergrutte produkten wurde algemien analysearre troch elektryske swurd, en hoege gjin isotopen te brûken, gjin radioaktive fersmoarging, en maklike promoasje.

● De suverens fan it eksimplaar is leech

D'r is gjin needsaak om firussen of baktearjes en kultuersellen te skieden.DNA-ruwe produkten en RNA kinne brûkt wurde as fersterkers.Detectie fan DNA-amplifikaasje kin direkt brûkt wurde mei klinyske eksimplaren lykas bloed, lichemsfloeistof, hoestwaskfluid, hier, sellen en libbend weefsel.

PCRmienskiplike problemen

● False negatyf, gjin fersterke bands

De wichtichste stadia fan 'e PCR-reaksje omfetsje: ① tarieding fan sjabloannukleïnesoeren, ② kwaliteit en spesifisiteit fan primers, ③ de kwaliteit fan enzymen ④ PCR-syklusbetingsten.It finen fan de reden moat ek wurde analysearre en studearre foar de boppesteande keppelings.

Sjabloanen: ① De sjabloan befettet ferskate proteïne, ② De sjabloan befettet in Taq-enzyminhibitor, ③ It proteïne yn 'e sjabloan wurdt net elimineare, benammen it groepprotein yn' e gromosoom.⑤ Deminer nucleic acid degeneraasje is net yngeand.As de kwaliteit fan enzymen en primers goed binne, is d'r gjin amplifikaasjeband, dat is nei alle gedachten de digestive behanneling fan eksimplaren.D'r is wat mis mei it sjabloan-nukleïnsûre-ekstraksjeproses, dus om in effektive en stabile spiisfertarringsoplossing te meitsjen, moat de proseduere fêststeld wurde en net willekeurich feroare.

Enzyme-ynaktivaasje: in nij enzym as beide âlde en nije enzymen moatte tegearre wurde brûkt om te analysearjen oft de enzymaktiviteit ferlern is of net genôch is, wat liedt ta falske negativen.Dêrby moat opmurken wurde dat Taq enzyme of ethidium bromide wurdt soms fergetten.

Primer: de kwaliteit fan de primer, de konsintraasje fan de primer, en oft de konsintraasje fan de twa primers symmetrysk is.It is in mienskiplike reden foar de PCR-mislearring of de tanimmende band is net ideaal en gefoelich foar diffuse.D'r binne problemen mei de kwaliteit fan 'e primers fan guon batchnûmers.De twa primers hawwe in hege konsintraasje en in lege konsintraasje, wêrtroch asymmetryske amplifikaasje leech-effisjinsje is.De tsjinmaatregels binne: ① Selektearje in goede primer om ienheden te syntetisearjen.② De konsintraasje fan 'e primer hinget net allinich ôf fan' e OD-wearde, mar jout ek omtinken oan 'e orizjinele floeistof fan' e primer om elektroforese fan agar-sûkergel te meitsjen.Der moat in primer strip sône, en de helderheid fan de twa primers moat wêze algemien konsekwint.Riem, PCR kin op dit stuit mislearje, en it moat wurde oplost mei de primersynthese-ienheid.As in primer heech is, is de helderheid leech, en syn konsintraasje moat lykwichtich wêze as it wurdt verdund.③ De primer moat wurde betelle en opslein yn in hege konsintraasje om meardere freezing of lange-termyn kuollingsdielen fan 'e kuolkast te foarkommen, wêrtroch't de primer feroarsaakje en degradearje.④ It ûntwerp fan 'e primer is ûnferstannich, lykas de lingte fan' e primer is net genôch, en de di-kluster wurdt foarme tusken de primers.

Mg2 + konsintraasje: Mg2 + ion konsintraasje hat in grutte ynfloed op PCR amplification effisjinsje.Oermjittige konsintraasje kin it tsjinoerstelde geslacht fan PCR-amplifikaasje ferminderje.As de konsintraasje te leech is, sil de PCR-amplifikaasjeútfier sels de PCR-amplifikaasjefout meitsje sûnder de útwreidingsband.

Feroaring fan reaksjevolumint: It folume brûkt yn PCR-amplifikaasje is 20ul, 30ul, en 50ul of 100uL, it grutte folume fan 'e applikaasje foar PCR-amplifikaasje is ynsteld neffens ferskate doelen fan wittenskiplik ûndersyk en klinyske testen.Nei it meitsjen fan lytse folumes lykas 20ul, is it nedich om in snoerbetingst te meitsjen by it meitsjen fan de grutte, oars sil it mislearje.

Fysike redenen: Transformaasje is heul wichtich foar PCR-amplifikaasje.As de degeneraasjetemperatuer leech is, is de degeneraasjetiid koart, it komt wierskynlik foar yn falske negativen;te lege annealing temperatuer kin feroarsaakje net-spesifike amplification en ferminderjen spesifike amplification effisjinsje.Heech beynfloedzje de kombinaasje fan primers en sjabloanen om PCR-amplifikaasje-effisjinsje te ferminderjen.Soms is it nedich om standert thermometers te brûken om de fariabiliteit, annealing en útwreide temperatuer yn 'e útwreiding of wetteroplosbere cooker te detektearjen, wat ien fan' e redenen is foar it mislearjen fan 'e PCR.

Farianten fan doelsekwinsje: As de doelsekwinsje optreedt, in mutaasje of wiskje, wurdt de kombinaasje fan it prototype en it sjabloan kombineare, of troch it ûntbrekken fan in doelsekwinsje, sille de primer en it sjabloan de komplementêre folchoarder ferlieze, en har PCR-amplifikaasje sil net suksesfol wêze.

● False posityf

De PCR-amplifikaasjeband ferskynt yn oerienstimming mei de doelsekwinsjeband, en soms is syn band kreaser en heger.

Primer-ûntwerp is net passend: de selekteare amplifikaasjesekwinsje en net-doel-amplifikaasje-sekwinsje hawwe homolooch, dus as PCR-amplifikaasje binne de amplified PCR-produkten net-doelfol sekwinsjes.De doelsekwinsje is te koart of de primer is te koart, en it is gefoelich foar falsk posityf.Moat wurde opnij ûntwurpen.

Krúsfersmoarging fan doelsekwinsje of amplifikaasjeprodukten: D'r binne twa redenen foar dizze fersmoarging: Earste krúsfersmoarging fan it hiele genom of grutte segminten, dy't liede ta falske positiven.Dit soarte fan falske posityf kin oplost wurde troch de folgjende metoaden: Wês foarsichtich en sêft ûnder operaasje om te foarkommen dat de doelsekwinsje ynademe yn it stekproefgewear of spat út 'e sintrifugale buis.Utsein enzymen en stoffen dy't gjin hege temperatueren kinne wjerstean, moatte alle reagentia as apparatuer mei hege druk desinfisearre wurde.De sintrifugale pipen en samples moatte tagelyk brûkt wurde.As it nedich is, foardat it tafoegjen fan eksimplaren, de reaksje buis en reagens wurde bleatsteld oan ultraviolet rays te ferneatigjen de besteande nucleic acid.Twad, lytse fragminten yn 'e loftfersmoarging.Dizze lytse fragminten binne koarter as de doelsekwinsje, mar se hawwe bepaalde homology.It kin wurde spliced ​​mei elkoar.Nei it oanfoljen fan de primers kin it PCR-produkt útwreide wurde, wat falske positive produksje feroarsaakje sil.It kin brûkt wurde om de nêst PCR-metoade te ferminderjen of te eliminearjen.

● Ferskynsel net-spesifike amplification band

De bands dy't ferskynden nei PCR amplification binne ynkonsistent mei de ferwachte grutte, of grut of lyts, of tagelyk, of tagelyk, spesifike amplification bands en net-spesifike amplification bands.It ûntstean fan net-spesifike bands is: Earst binne de primers ûnfolslein komplemintêr foar de doelsekwinsje, of de polymerisaasje fan 'e primer om in di-kluster te foarmjen.De twadde is dat de konsintraasje fan MG2 + ionen is te heech, de annealing temperatuer is te leech, en it oantal PCR cycles is besibbe.Twad, de kwaliteit en it bedrach fan enzymen.Faak binne enzymen fan guon boarnen gefoelich foar net-spesjale bands en de enzymen fan 'e oare boarne komme net foar.Soms komt ek net-spesifike amplifikaasje fan enzymen foar.De tsjinmaatregels binne: oantreklike attraksjes as it nedich is op 'e nij.Ferminderje de hoemannichte enzyme of ferfange it enzym fan in oare boarne.Ferminderje it bedrach fan primêr, fergrutsje it bedrach fan sjabloanen passend, en ferminderje it oantal syklusen.Ferheegje de annealingtemperatuer goed of brûk de twa temperatuerpuntmetoade (93 ° C degeneraasje, annealing en útwreidzje op sawat 65 ° C).

● Ferskynsel flaky tow of smeer tape

PCR-amplifikaasje liket soms te wurde tapast of skelpen of tapyt-like riem.Om de reden, troch it oerstallige bedrach fan enzymen of de minne kwaliteit fan it enzym, is de dNTP-konsintraasje te heech, de Mg2+-konsintraasje is te heech, de annealingtemperatuer is te leech, en it oantal syklusen is te folle.De tsjinmaatregels binne: ①Redigje it bedrach fan enzymen, of feroarje it enzym fan in oare boarne.② Ferminderje de konsintraasje fan dNTP ③ Ferminderje Mg2+ konsintraasje goed.④ Fergrutsje de kwantiteit fan sjabloanen en ferminderje it oantal syklusen.

relatearre produkten

PCR Heroᵀᴹ (mei kleurstof)

◮ Hegere trou: 6 kear dat fan gewoane Taq-enzyme;

◮ Snellere fersterkingssnelheid

◮ Mear oanpassingsfermogen foar sjabloanen

◮ Hegere amplifikaasje-effisjinsje

◮ Miljeutolerânsje is sterker: pleatst op 37 ° C foar in wike, behâld fan mear as 90% aktiviteit;

◮ It hat 5'→3' DNA polymerase aktiviteit en 5'→3' exonuclease aktiviteit, sûnder 3'→5' exonuclease aktiviteit.

PCR Easyᵀᴹ (mei kleurstof)

It unike reaksjesysteem en hege-effisjinsje Taq DNA Polymerase meitsje dat de PCR-reaksje hegere amplifikaasje-effisjinsje, spesifisiteit en gefoelichheid hat.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Green I

◮ Ien-stap kit makket omkearde transkripsje en qPCR twa reaksjes yn deselde buis, hoecht allinich sjabloan RNA ta te foegjen, spesifike PCR-primers en RNase-frije ddH₂O.

◮ De kit kin fluch en effisjint kwantitatyf analysearje virale RNA of trace RNA.

◮ De kit brûkt in unyk Foregene reverse transcription reagens en Foregene HotStar Taq DNA Polymerase kombinearre mei in unyk reaksjesysteem om de amplifikaasje-effisjinsje en spesifisiteit fan 'e reaksje effektyf te ferbetterjen.

◮ It optimalisearre reaksjesysteem makket dat de reaksje in hegere deteksjesensitiviteit hat, sterkere thermyske stabiliteit en bettere tolerânsje.

◮ RT-qPCR Maklik^TM(Ien Stap) -SYBR Green I kit komt mei ROX ynterne referinsje kleurstof, dat kin brûkt wurde om elimineren sinjaal eftergrûn en sinjaal flaters tusken putten, dat is handich foar klanten in gebrûk yn ferskate modellen fan kwantitative PCR ynstruminten.

RT Easy^TMII (Master Premix foar earste-string cDNA synteze foarReal Time PCR)

-Efficiency mooglikheid om te ferwiderjen gDNA, dat kin fuortsmite gDNA yn it sjabloan binnen 2 minuten.

- Effisjint systeem foar reverse transkripsje, it duorret mar 15 minuten om de synteze fan 'e earste strân cDNA te foltôgjen.

-Komplekse sjabloanen: sjabloanen mei hege GC-ynhâld en komplekse sekundêre struktuer kinne ek wurde omkeard mei hege effisjinsje.

-Reverse transkripsjesysteem mei hege gefoelichheid, sjabloanen op pg-nivo kinne ek cDNA fan hege kwaliteit krije.

-It omkearde transkripsjesysteem hat hege thermyske stabiliteit, de optimale reaksjetemperatuer is 42 ℃, en it hat noch altyd goede reverse-transkripsjeprestaasjes by 50 ℃.