Ⅰ. Fergrutsje de gefoelichheid fan it reaksjesysteem:

1. Skied RNA fan hege kwaliteit:

Súksesfolle cDNA-synteze komt út RNA fan hege kwaliteit.RNA fan hege kwaliteit moat op syn minst in totaal langer soargje en befettet gjin ynhibitoren dy't gjin opname-enzymen befetsje, lykas EDTA of SDS.De kwaliteit fan RNA bepaalt de maksimale wearde fan 'e folchoarderynformaasje dy't jo kinne transkrije nei it cDNA.De algemiene RNA-suveringsmetoade is in stapmetoade foar it brûken fan isoocyanate/acidophenol.Om de fersmoarging fan RNase te foarkommen, fereasket it RNA dat is skieden fan in stekproef ryk oan RNase (lykas panko's) opslach fan formaldehyde om RNA fan hege kwaliteit te bewarjen, wat noch mear sa is foar opslach op lange termyn.It RNA ekstrahearre út 'e rattelever waard yn prinsipe degradearre nei ien wike fan opslach yn wetter, wylst it RNA ekstrahearre út' e rattemilt stabyl bleau nei trije jier opslach yn wetter.Derneist binne transkripsjes grutter dan 4kb gefoeliger foar trace RNase-degradaasje dan lytse transkripsjes.Om de stabiliteit fan it opslach-RNA-monster te fergrutsjen, kin it RNA oplost wurde yn in methalmamine fan ion, en wurdt opslein -70 °C.Thylide brûkt om RNA te bewarjen, moat gjin ferskate objekten befetsje dy't RNA degradearje.RNA, dat is ôflaat fan panko's, kin op syn minst ien jier bewarre wurde yn methalmamine.As jo ​​​​klear binne om RNA te brûken, kinne jo de folgjende metoaden brûke om RNA te precipitearjen: NaCl taheakje oan 0.2m en 4 kear it folume fan ethanol, pleatse keamertemperatuer foar 3-5 minuten, en 10.000 × g centrifugaal foar 5 minuten.

2. Brûk reverse transkriptase sûnder RNaseH-aktiviteit (RNaseH-):

RNase-ynhibitoren wurde faak tafoege oan omkearde transkripsjereaksjes om de lingte en opbringst fan cDNA-synteze te fergrutsjen.RNase-ynhibitor wurdt tafoege yn 'e earste ketensynteze-reaksje yn' e oanwêzigens fan buffers en ferminderjende aginten lykas DTT, om't it pre-cDNA-syntezeproses de ynhibitor denaturearret, wêrtroch't bûne RNases frijlitte dy't RNA degradearje.Protein RNase-ynhibitor foarkomt allinich de degradaasje fan RNA troch RNase A, B, C, en foarkomt RNases net op 'e hûd, sadat der foarsichtich wurde moat dat RNases net fan' e fingers ynfierd wurde nettsjinsteande it gebrûk fan dizze ynhibitoren.

Reverse transkriptase katalysearret de konverzje fan RNA yn cDNA.Sawol M-MLV as AMV hawwe endogene RNaseH-aktiviteit neist har eigen polymerase-aktiviteit.RNaseH-aktiviteit konkurrearret mei polymerase-aktiviteit foar heterozygote stringen dy't foarme binne tusken RNA-sjabloanen en DNA-primers as cDNA-útwreidingsstrengen, en degradearret RNA: RNA-strengen yn DNA-kompleksen.RNA-sjabloanen degradearre troch RNaseH-aktiviteit kinne net langer brûkt wurde as effektive substraten foar cDNA-synteze, wat de opbringst en lingte fan cDNA-synteze ferminderje.Sa soe it eliminearjen of sterk ferminderjen fan RNaseH-aktiviteit fan reverse transkriptase fan grut foardiel wêze.

SuperScriptⅡ reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase fan RNaseH- en thermoScript reverse transcriptase, AMV fan RNaseH- levere mear cDNA fan folsleine lingte dan MMLV en AMV.RT-PCR-sensitiviteit wurdt beynfloede troch it bedrach fan synthesized cDNA.ThermoScript is folle gefoeliger dan AMV.De grutte fan RT-PCR-produkten wurdt beheind troch it fermogen fan reverse transkriptase om cDNA te syntetisearjen, benammen by it klonen fan gruttere Cdna's.Yn ferliking mei MMLV fergrutte SuperScripⅡ de opbringst fan lange RT-PCR-produkten signifikant.RNaseH-'s omkearde transkriptase fergruttet ek thermyske stabiliteit, sadat de reaksje kin wurde útfierd by temperatueren heger as normaal fan 37-42 ℃.Under de foarstelde syntezebetingsten waarden oligo (dT) primers en 10μCi [alpha-p]dCTP brûkt.De totale produksje fan 'e earste keten waard berekkene mei de TCA-ôfslachmetoade.Folsleine cDNA waard analysearre mei help fan grutte-sortearre stripferwidering en tellen yn in alkaline agarosegel.

3. Ferheegje de waarmtebehâldtemperatuer fan omkearde transkripsje:

Hegere holdingtemperatuer helpt om de sekundêre struktuer fan RNA te iepenjen en de opbringst fan 'e reaksje te ferheegjen.Foar de measte RNA-sjabloanen, it hâlden fan de RNA en primer op 65 ° C sûnder buffer of sâlt en dan koelje se fluch op iis elimineert de measte sekundêre struktueren en lit de primers te binen.Guon sjabloanen hawwe lykwols noch sekundêre struktuer, sels nei termyske denaturaasje.Amplification fan dizze drege sjabloanen kin wurde útfierd mei help fan ThermoScript reverse transcriptase en troch it pleatsen fan de reverse transcriptase reaksje op hegere temperatueren te ferbetterjen amplification.Hegere holding temperatueren kinne ek tanimme spesifisiteit, benammen as cDNA synteze wurdt útfierd mei help fan gene-spesifike primers (GSPS) (sjoch Haadstik 3).As jo ​​​​GSP brûke, soargje derfoar dat de Tm-wearde fan 'e primer itselde is as de ferwachte holdtemperatuer.Brûk gjin oligo(dT) en willekeurige primers boppe 60 ℃.Willekeurige primers moatte wurde hâlden op 25 ℃ foar 10 minuten foardat se ferheegje nei 60 ℃.Neist it brûken fan hegere omkearde transkripsjetemperatueren, kin spesifisiteit wurde ferbettere troch it direkt oerdragen fan it RNA / primergemik fan 'e denaturearjende temperatuer fan 65 ℃ nei de temperatuer foar it hâlden fan omkearde transkripsje en it tafoegjen fan in foarferwaarme 2 × reaksjegemik (cDNA-thermyske inisjaasjesynthese).Dizze oanpak helpt foar te kommen dat de intermolekulêre basispaaring komt by legere temperatueren.It brûken fan in PCR-ynstrumint simplifies de protte temperatuerskeakels dy't nedich binne foar RT-PCR.

Tth waarmtestabilisearre polymerase fungearret as DNA-polymerase yn 'e oanwêzigens fan Mg2+ en RNA-polymerase yn 'e oanwêzigens fan Mn2+.It kin waarmte hâlde oant 65 ℃.De oanwêzigens fan Mn2+ tidens PCR ferminderet lykwols trou, wat Tth-polymerase minder geskikt makket foar amplifikaasje mei hege presyzje, lykas cDNA-kloning.Dêrnjonken is Tth minder effisjint by omkearde transkripsje, wat de gefoelichheid ferminderet, en om't in inkeld enzym omkearde transkripsje en PCR kin útfiere, kinne kontrôlereaksjes sûnder omkearde transkripsje net brûkt wurde om fersterke produkten fan cDNA te ûnderskieden fan dy fan kontaminearre genomysk DNA.

4. Additive dat omkearde transkripsje befoarderet:

De tafoeging fan tafoegings, ynklusyf glycerine en DMSO, oan 'e earste ketensynteze-reaksje kin de stabiliteit fan' e dûbele strân fan 'e nukleïnsûre ferminderje en de sekundêre struktuer fan RNA ûntspanne.Oant 20% glycerine of 10% DMSO kinne wurde tafoege sûnder de aktiviteit fan SuperScriptⅡ of MMLV te beynfloedzjen.AMV kin ek oant 20% glycerol tolerearje sûnder aktiviteit te ferminderjen.Om de gefoelichheid fan RT-PCR yn SuperScriptⅡ reverse transkripsjereaksje te maksimalisearjen, kin 10% glycerol wurde tafoege en isolearre by 45 ℃.As 1/10 fan it produkt fan 'e retrotranskripsje-reaksje wurdt tafoege oan' e PCR, is de konsintraasje fan glycerol yn 'e amplifikaasjereaksje 0,4%, wat net genôch is om PCR te remmen.

5. RNaseH ferwurking:

Gefoelichheid kin ferbettere wurde troch behanneling fan cDNA-synteze-reaksjes mei RNaseH foarôfgeand oan PCR.Foar guon sjabloanen wurdt tocht dat it RNA yn 'e cDNA-synthese-reaksje de bining fan fersterke produkten foarkomt, yn dat gefal kin de RNaseH-behanneling de gefoelichheid ferheegje.Yn 't algemien is RNaseH-behanneling fereaske foar de amplifikaasje fan in relatyf lange cDNA-doelsjabloan mei folsleine lingte, lykas tuberous scherosisⅡ mei lege kopy.Foar dit lestige sjabloan ferbettere RNaseH it sinjaal generearre troch it cDNA synthesized troch SuperScriptⅡ of AMV.Foar de measte RT-PCR-reaksjes is de RNaseH-behanneling opsjoneel omdat de 95 ℃ isolearre PCR-denaturaasjestap typysk it RNA fan it RNA: DNA-kompleks hydrolyseart.

6. Ferbettere metoaden foar it opspoaren fan lytse hoemannichten RNA:

RT-PCR is benammen útdaagjend as mar lytse hoemannichten RNA beskikber binne.De tafoeging fan glycogen as drager by RNA-skieding helpt om de opbringst fan lytse samples te ferheegjen.In RNase-frije glycogen kin tagelyk wurde tafoege as Trizol.Glykogen is wetteroplosber en kin yn 'e wetterfaze bliuwe mei RNA om te helpen by folgjende delslach.De oanrikkemandearre konsintraasje fan RNase-frije glycogen is 250μg / ml foar samples minder dan 50mg weefsel of 106 kweekte sellen.

De tafoeging fan acetyleare BSA om transkripsjereaksjes te kearen mei SuperScriptⅡ kin de gefoelichheid ferheegje, en foar lytse hoemannichten RNA kin it ferminderjen fan it bedrach fan SuperScriptⅡ en it tafoegjen fan 40 ienheden fan RNaseOut nuklease-inhibitor it deteksjenivo ferbetterje.As glycogen wurdt brûkt yn RNA-skieding, wurdt de tafoeging fan BSA- of RNase-ynhibitoren om transkripsjereaksjes te kearen mei SuperScriptⅡ noch altyd oan te rieden.

Ⅱ. Ferheegje de spesifisiteit fan RT-PCR

1. cNDA synteze:

Trije ferskillende metoaden kinne brûkt wurde om earste strân cDNA synteze te begjinnen, en de relative spesifisiteit fan elke metoade beynfloedet it bedrach en it type fan synthesized cDNA.

Random primer metoade is de minste spesifyk fan de trije metoaden.Primers wurde annealed op meardere siden yn 'e heule transkript om koart cDNA te produsearjen mei in diellange.Dizze metoade wurdt faak brûkt om 5′-terminale sekwinsjes en cDNA te krijen fan RNA-sjabloanen mei sekundêre strukturele regio's of mei beëinigjende siden dy't omkearde transkriptase net replikearje kinne.Om it langste cDNA te krijen, moat de ferhâlding fan primers oant RNA yn elke RNA-monster empirysk wurde bepaald.De earste konsintraasje fan willekeurige primers farieart fan 50 oant 250ng per 20μl reaksjesysteem.Om't de cDNA synthesized út totaal RNA mei help fan willekeurige primers is benammen ribosomal RNA, poly (A) + RNA wurdt algemien selektearre as de sjabloan.

Oligo (dT) inisjatyf is mear spesifyk dan willekeurige primers.It hybridisearret mei de poly (A) sturt fûn oan it 3'-ein fan mRNA yn de measte eukaryote sellen.Om't poly(A) + RNA rûchwei 1% oant 2% fan totale RNA is, is it bedrach en kompleksiteit fan cDNA folle minder dan as willekeurige primers waarden brûkt.Fanwegen syn hege spesifisiteit fereasket oligo(dT) oer it algemien gjin optimalisaasje foar RNA nei primerferhâlding en poly(A)+ seleksje.It is oan te rieden om 0.5μg oligo (dT) per 20μl reaksjesysteem te brûken.oligo(dT)12-18 is geskikt foar de measte RT-PCR.ThermoScript RT-PCR System jout oligo (dT) 20 fanwege syn goede termyske stabiliteit en is geskikt foar hegere holding temperatueren.

Gene-spesifike primers (GSP) binne de bêste spesifike primers foar de omkearde transkripsjestap.GSP is in antisense oligonucleoside dy't spesifyk kin hybridisearje mei RNA-bestimmingsekwinsjes, ynstee fan anneal alle Rna's lykas willekeurige primers of oligo (dT).De regels dy't brûkt wurde foar it ûntwerpen fan PCR-primers jilde ek foar it ûntwerp fan omkearde transkripsjereaksje GSP.GSP kin deselde folchoarder wêze as de amplifikaasjeprimer annealed oan 'e ein fan mRNA3', of GSP kin wurde ûntworpen om streamôfwerts te annealed mei de reverse amplification primer.Foar guon fersterke objekten is it nedich om mear as ien antisense-primer te ûntwerpen foar suksesfolle RT-PCR, om't de sekundêre struktuer fan it doel-RNA kin foarkomme dat de primer bining.It wurdt suggerearre om 1pmol antisense GSP te brûken yn it earste ketensynthese-reaksjesysteem fan 20μl.

2. Ferheegje de waarmtebehâldtemperatuer fan omkearde transkripsje:

Om folslein foardiel te nimmen fan GSP-spesifisiteit, moat reverse transkriptase mei hege thermyske stabiliteit brûkt wurde.Heat-stabile reverse transkriptase kin isolearre wurde by hegere temperatueren om reaksje rigor te fergrutsjen.Bygelyks, as in GSP wurdt annealed by 55 ° C, dan wurdt de spesifisiteit fan GSP net folslein brûkt as omkearde transkripsje wurdt útfierd op 37 ° C mei lege strangens mei help fan AMV of M-MLV.SuperScripⅡ en ThermoScript kinne lykwols reagearje op 50 ℃ of heger, wat net-spesifike produkten elimineert produsearre by legere temperatueren.Foar maksimale spesifisiteit kin it RNA / primergemik direkt wurde oerbrocht fan 'e denaturaasjetemperatuer fan 65 ℃ nei de temperatuer foar it hâlden fan omkearde transkripsje mei de tafoeging fan in foarferwaarme 2 x reaksjegemik (thermyske inisjatyf fan cDNA-synteze).Dit helpt foar te kommen dat baseparing tusken molekulen by lege temperatueren foarkomme.It brûken fan in PCR-ynstrumint simplifies de protte temperatuertransysjes dy't nedich binne foar RT-PCR.

3. Ferminderje genomyske DNA-fersmoarging:

Ien potinsjele muoite mei RT-PCR is dat RNA genomysk DNA kontaminearret.It gebrûk fan bettere metoaden foar RNA-skieding, lykas Trizol-reagens, ferminderet genomyske DNA-fersmoarging yn RNA-preparaten.Om produkten produsearre út genomysk DNA te foarkommen, kin it RNA wurde behannele mei amplifikaasjegraad DnasⅠ om kontaminearre DNA te ferwiderjen foarôfgeand oan omkearde transkripsje.De samples waarden hâlden op 65 ℃ yn 2.0mM EDTA foar 10 min om DNaseⅠ spiisfertarring te beëinigjen.EDTA chelaat magnesium-ionen om de magnesiumion-ôfhinklike RNA-hydrolyse te foarkommen dy't op hege temperatueren foarkomt.

Om amplified cDNA te skieden fan it genoom-DNA-amplifikaasjeprodukt, kinne primers dy't apart annealje mei it skieden ekson wurde ûntwurpen.PCR-produkten ôflaat fan cDNA sille koarter wêze dan dy ôflaat fan kontaminearre genomysk DNA.In kontrolearre eksperimint sûnder omkearde transkripsje wurdt ek útfierd op elke RNA-sjabloan om te bepalen oft in bepaald fragmint fan genomysk DNA of cDNA is.PCR-produkten krigen yn it ûntbrekken fan omkearde transkripsje binne ôflaat fan it genom.

Related Product

RT-PCR Maklik^ᵀᴹI (ien stap)

-De ien-stap kit makket it mooglik omkearde transkripsje en PCR te wurde útfierd yn deselde buis.It hoecht allinich sjabloan-RNA, spesifike PCR-primers en RNase-Free ddH ta te foegjen₂O.

-Real-time kwantitative analyze fan RNA kin fluch en sekuer wurde útfierd.

-De kit brûkt in unyk Foregene reverse transcription reagens en Foregene HotStar Taq DNA Polymerase kombinearre mei in unyk reaksje systeem om effektyf ferbetterjen de amplification effisjinsje en spesifisiteit fan de reaksje.

-De optimalisearre reaksje systeem makket de reaksje hawwe hegere deteksje gefoelichheid, sterker termyske stabiliteit, en bettere tolerânsje.

RT Easy II (Mei GDNase) Master Premix foar earste-string CDNA-synteze foar Real Time PCR Mei GDNase

-Efficiency mooglikheid om te ferwiderjen gDNA, dat kin fuortsmite gDNA yn it sjabloan binnen 2 minuten.

- Effisjint systeem foar reverse transkripsje, it duorret mar 15 minuten om de synteze fan 'e earste strân cDNA te foltôgjen.

-Komplekse sjabloanen: sjabloanen mei hege GC-ynhâld en komplekse sekundêre struktuer kinne ek wurde omkeard mei hege effisjinsje.

-Reverse transkripsjesysteem mei hege gefoelichheid, sjabloanen op pg-nivo kinne ek cDNA fan hege kwaliteit krije.

-It omkearde transkripsjesysteem hat hege thermyske stabiliteit, de optimale reaksjetemperatuer is 42 ℃, en it hat noch altyd goede reverse-transkripsjeprestaasjes by 50 ℃.