一, Fergrutsje de gefoelichheid fan it reaksje systeem:

1. Isolearje RNA fan hege kwaliteit:

Súksesfolle cDNA-synteze komt út RNA fan hege kwaliteit.RNA fan hege kwaliteit moat op syn minst folsleine lingte wêze en frij fan reverse transkriptase-ynhibitoren lykas EDTA of SDS.De kwaliteit fan RNA bepaalt de maksimale hoemannichte folchoarderynformaasje dy't jo kinne transkrije yn cDNA.In mienskiplike metoade foar RNA-suvering is in ienstapmetoade mei guanidine-isothiocyanat / soerfenol.Om kontaminaasje te foarkommen troch spoaren fan RNase, moat RNA isolearre út RNase-rike samples (lykas panko's) wurde opslein yn formaldehyde om RNA fan hege kwaliteit te behâlden, benammen foar opslach op lange termyn.It RNA ekstrahearre út ratlever waard yn prinsipe degradearre nei't se ien wike yn wetter waarden opslein, wylst it RNA ekstrahearre út rattemilt stabyl bleau nei't se 3 jier yn wetter waarden opslein.Derneist binne transkripsjes langer dan 4 kb gefoeliger foar degradaasje troch spoaren RNases as lytse transkripsjes.Om de stabiliteit fan opsleine RNA-samples te ferheegjen, kin RNA wurde oplost yn deionisearre formamide en opslein by -70 ° C.Formamide brûkt om RNA te behâlden moat frij wêze fan RNA-degradearjende pún.RNA fan panko's kin op syn minst ien jier yn formamide bewarre wurde.By it tarieden fan it brûken fan RNA, kinne jo de folgjende metoade brûke om RNA te precipitearjen: NaCl taheakje oan 0,2M en 4 kear it folume fan ethanol, pleatse by keamertemperatuer foar 3-5 minuten, en sintrifugerje op 10.000 × g foar 5 minuten.

2. Brûk de RNaseH-ynaktive (RNaseH-) reverse transkriptase:

RNase-ynhibitoren wurde faak tafoege oan omkearde transkripsjereaksjes om de lingte en opbringst fan cDNA-synteze te fergrutsjen.RNase-ynhibitoren moatte wurde tafoege tidens de earste-string-synthese-reaksje yn 'e oanwêzigens fan in buffer en in reduksjemiddel (lykas DTT), om't it proses foarôfgeand oan cDNA-synteze de ynhibitor denaturearret, en dêrmei bûn RNase frijlitte dy't RNA kin degradearje.Protein RNase-ynhibitoren foarkomme allinich de degradaasje fan RNA troch RNase A, B, C, en foarkomme RNase net op 'e hûd, dus wês foarsichtich om RNase net fan jo fingers yn te fieren nettsjinsteande it gebrûk fan dizze ynhibitoren.

Reverse transkriptase katalysearret de konverzje fan RNA nei cDNA.Sawol M-MLV as AMV hawwe endogene RNaseH-aktiviteit neist har eigen polymerase-aktiviteit.RNaseH-aktiviteit en polymerase-aktiviteit konkurrearje mei elkoar foar de hybride strân foarme tusken de RNA-sjabloan en de DNA-primer of cDNA-útwreidingstreng, en degradearje de RNA-strân yn it RNA: DNA-kompleks.De RNA-sjabloan degradearre troch RNaseH-aktiviteit kin net langer tsjinje as in effektyf substraat foar cDNA-synteze, wat de opbringst en lingte fan cDNA-synteze ferminderet.Dêrom soe it foardielich wêze om de RNaseH-aktiviteit fan reverse transkriptase te eliminearjen of sterk te ferminderjen.

SuperScript Ⅱ reverse transcriptase, RNaseH-MMLV reverse transcriptase en thermoScript reverse transcriptase, RNaseH-AMV, kinne mear bedrach en mear cDNA fan folsleine lingte krije dan MMLV en AMV.RT-PCR-sensitiviteit sil wurde beynfloede troch it bedrach fan cDNA-synteze.ThermoScript is folle gefoeliger dan AMV.De grutte fan RT-PCR-produkten wurdt beheind troch it fermogen fan reverse transkriptase om cDNA te syntetisearjen, benammen by it klonen fan gruttere cDNA's.Yn ferliking mei MMLV fergrutte SuperScripⅡ de opbringst fan lange RT-PCR-produkten signifikant.De RNaseH-reverse transkriptase hat ek ferhege thermostabiliteit, sadat de reaksje kin wurde útfierd by temperatueren heger as de normale 37-42 ° C.Under de foarstelde syntezebetingsten brûke oligo(dT) primer en 10 μCi fan [α-P]dCTP.De totale opbringst fan earste strân waard berekkene mei de TCA delslach metoade.Folsleine cDNA waard analysearre mei grutte-sortearre bands útsletten en teld op in alkaline agarosegel.

3. Ferheegje de ynkubaasjetemperatuer foar omkearde transkripsje:

In hegere ynkubaasjetemperatuer helpt om de sekundêre struktuer fan RNA te iepenjen, wêrtroch de opbringst fan 'e reaksje ferheget.Foar de measte RNA-sjabloanen sil it ynkubearjen fan de RNA en primers by 65 ° C sûnder buffer of sâlt, folge troch rappe koeling op iis, de measte sekundêre struktueren eliminearje en primers kinne bine.Guon sjabloanen hawwe lykwols noch sekundêre struktueren, sels nei denaturaasje fan waarmte.Amplifikaasje fan dizze lestige sjabloanen kin wurde útfierd mei ThermoScript Reverse Transcriptase en it pleatsen fan de reverse transkripsjereaksje op in hegere temperatuer om amplifikaasje te ferbetterjen.Hegere incubation temperatueren kinne ek tanimme spesifisiteit, benammen as gene-spesifike primers (GSP) wurde brûkt foar cDNA synteze (sjoch haadstik 3).As jo ​​​​GSP brûke, soargje derfoar dat de Tm fan 'e primers itselde is as de ferwachte ynkubaasjetemperatuer.Brûk gjin oligo(dT) en willekeurige primers boppe 60 °C.Willekeurige primers fereaskje inkubaasje by 25 ° C foar 10 minuten foardat se ferheegje nei 60 ° C.Neist it brûken fan in hegere omkearde transkripsjetemperatuer kin spesifisiteit ek ferbettere wurde troch it direkt oerbringen fan it RNA / primer-mix fan 'e 65 ° C denaturaasjetemperatuer nei de reverse transkripsje-ynkubaasjetemperatuer en it tafoegjen fan in foarferwaarmde 2 × reaksjegemik (cDNA hot-start synteze).Dizze oanpak helpt foar te kommen dat de intermolekulêre basispaaring komt by legere temperatueren.De meardere temperatuerwikseling dy't nedich is foar RT-PCR kin wurde ferienfâldige troch it brûken fan in termyske cycler.

Tth thermostabile polymerase fungearret as in DNA-polymerase yn 'e oanwêzigens fan Mg2+ en as in RNA-polymerase yn 'e oanwêzigens fan Mn2+.It kin waarm hâlden wurde op in maksimum temperatuer fan 65 ° C.De oanwêzigens fan Mn2+ tidens PCR ferminderet lykwols fidelity, wat Tth-polymerase minder geskikt makket foar amplifikaasje mei hege presyzje, lykas klonen fan cDNA.Derneist hat Tth lege effisjinsje fan omkearde transkripsje, wat gefoelichheid ferminderet, en, om't omkearde transkripsje en PCR kinne wurde útfierd mei ien inkeld enzyme, kinne kontrôlereaksjes sûnder omkearde transkripsje net brûkt wurde om cDNA-amplifikaasjeprodukten te fergelykjen mei kontaminearjend genomysk DNA.De amplifikaasjeprodukten waarden skieden.

4. Additieven dy't omkearde transkripsje befoarderje:

Additiven ynklusyf glycerol en DMSO wurde tafoege oan de earste-string synteze reaksje, dat kin ferminderjen de stabiliteit fan de nucleic acid dûbele-string en untie de sekundêre struktuer fan RNA.Oant 20% glycerol of 10% DMSO kinne wurde tafoege sûnder SuperScript II- of MMLV-aktiviteit te beynfloedzjen.AMV kin ek tolerearje oant 20% glycerol sûnder ferlies fan aktiviteit.Om de gefoelichheid fan RT-PCR yn 'e SuperScriptⅡ reverse transkripsjereaksje te maksimalisearjen, kin 10% glycerol wurde tafoege en ynkubeare by 45 ° C.As 1/10 fan it produkt fan 'e omkearde transkripsje-reaksje wurdt tafoege oan PCR, dan is de konsintraasje fan glycerol yn' e amplifikaasjereaksje 0,4%, wat net genôch is om PCR te remmen.

5. RNaseH behannelje:

Behanneling fan cDNA-synteze-reaksjes mei RNaseH foarôfgeand oan PCR kin gefoelichheid ferheegje.Foar guon sjabloanen wurdt tocht dat RNA yn 'e cDNA synteze reaksje foarkomt de bining fan amplification produkten, yn hokker gefal RNaseH behanneling kin tanimme gefoelichheid.Yn 't algemien is RNaseH-behanneling needsaaklik by it fersterkjen fan langere cDNA-doelsjabloanen fan folsleine lingte, lykas tuberous scherosis II mei lege kopy.Foar dizze drege sjabloan ferbettere RNaseH behanneling it sinjaal produsearre troch SuperScript II of AMV-synthesized cDNA.Foar de measte RT-PCR-reaksjes is RNaseH-behanneling opsjoneel, om't de PCR-denaturaasjestap by 95 ° C it RNA yn it RNA: DNA-kompleks oer it algemien hydrolyseart.

6. Ferbettering fan Lytse RNA-deteksjemetoade:

RT-PCR is foaral útdaagjend as mar lytse hoemannichten RNA beskikber binne.Glykogen tafoege as drager tidens RNA-isolaasje helpt om de opbringst fan lytse samples te ferheegjen.RNase-frije glycogen kin tagelyk tafoege wurde as it tafoegjen fan Trizol.Glykogen is wetteroplosber en kin wurde hâlden yn 'e wetterige faze mei RNA om de folgjende delslach te helpen.Foar samples minder dan 50 mg weefsel of 106 kweekte sellen is de oanrikkemandearre konsintraasje fan RNase-frije glycogen 250 μg / ml.

It tafoegjen fan acetylearre BSA oan 'e omkearde transkripsjereaksje mei SuperScript II kin de gefoelichheid ferheegje, en foar lytse hoemannichten RNA kin it ferminderjen fan it bedrach fan SuperScript II en it tafoegjen fan 40 ienheden fan RNaseOut nuklease-inhibitor it nivo fan deteksje ferheegje.As glycogen wurdt brûkt yn it RNA-isolaasjeproses, wurdt it noch altyd oanrikkemandearre om BSA of RNase-inhibitor ta te foegjen by it brûken fan SuperScript II foar omkearde transkripsjereaksje.

二, Fergrutsje RT-PCR spesifisiteit

1. CND Asynteze:

Earste-string cDNA-synteze kin wurde inisjeare mei trije ferskillende metoaden, wêrfan de relative spesifisiteit ynfloed hat op it bedrach en type fan synthesized cDNA.

De willekeurige primermetoade wie de minste spesifyk fan 'e trije metoaden.Primers annealje op meardere plakken yn it heule transkript, en generearje koarte cDNA's fan in part-lingte.Dizze metoade wurdt faak brûkt om 5′-einsekwinsjes te krijen en cDNA te krijen fan RNA-sjabloanen mei regio's fan sekundêre struktuer of mei beëinigingssiden dy't net kinne wurde replikearre troch reverse transkriptase.Om it langste cDNA te krijen, moat de ferhâlding fan primers oant RNA yn elke RNA-monster empirysk wurde bepaald.De begjinkonsintraasje fan willekeurige primers rûn fan 50 oant 250 ng per 20 μl reaksje.Sûnt cDNA synthesized út totaal RNA mei help fan willekeurige primers is yn it foarste plak ribosomal RNA, poly (A) + RNA wurdt algemien keazen as de sjabloan.

Oligo (dT) primers binne spesifiker dan willekeurige primers.It hybridisearret oan 'e poly (A) sturt fûn oan' e 3'-ein fan 'e measte eukaryotyske mRNA's.Om't poly(A)+ RNA sawat 1% oant 2% fan totale RNA is, is it bedrach en kompleksiteit fan cDNA folle minder dan mei willekeurige primers.Fanwege syn hege spesifisiteit fereasket oligo (dT) oer it algemien gjin optimalisaasje fan 'e ferhâlding fan RNA nei primers en poly (A) + seleksje.It is oan te rieden om 0.5μg oligo (dT) per 20μl reaksjesysteem te brûken.oligo(dT)12-18 is geskikt foar de measte RT-PCR.It ThermoScript RT-PCR-systeem biedt oligo(dT)20 fanwegen syn bettere thermyske stabiliteit foar hegere ynkubaasjetemperatueren.

Gene spesifike primers (GSP) binne de meast spesifike primers foar de omkearde transkripsjestap.GSP is in antisense oligonucleotide dat spesifyk kin hybridisearje oan 'e RNA-doelsekwinsje, yn tsjinstelling ta willekeurige primers of oligo (dT), dy't annealje oan alle RNA's.Deselde regels dy't brûkt wurde foar it ûntwerpen fan PCR-primers jilde foar it ûntwerp fan GSP yn omkearde transkripsjereaksjes.De GSP kin deselde folchoarder wêze as de amplifikaasjeprimer dy't anneals oan it 3'-meast ein fan 'e mRNA, of de GSP kin wurde ûntworpen om streamôfwerts fan' e omkearde amplifikaasjeprimer te annealjen.Foar guon fersterke ûnderwerpen moat mear as ien antisense-primer ûntwurpen wurde foar suksesfolle RT-PCR, om't de sekundêre struktuer fan it doel-RNA primerbinding kin foarkomme.It is oan te rieden om 1 pmol antisense GSP te brûken yn in 20 μl earste-string synteze reaksje.

2. Ferheegje de ynkubaasjetemperatuer foar omkearde transkripsje:

Om folslein foardiel te nimmen fan it folsleine foardiel fan GSP-spesifisiteit, moat in reverse transkriptase mei hegere thermostabiliteit brûkt wurde.Thermostabiele reverse transkriptases kinne wurde ynkubeare by hegere temperatueren om reaksjestringens te ferheegjen.Bygelyks, as in GSP anneals by 55 ° C, sil de spesifisiteit fan 'e GSP net folslein brûkt wurde as AMV of M-MLV wurdt brûkt foar omkearde transkripsje op in lege stringens fan 37 ° C.SuperScript II en ThermoScript kinne lykwols reagearre wurde op 50 ° C of heger, wat net-spesifike produkten sil eliminearje dy't genereare by legere temperatueren.Foar maksimale spesifisiteit kin de RNA / primer-mix direkt wurde oerbrocht fan 'e 65 ° C denaturaasjetemperatuer nei de reverse transkripsje-inkubaasjetemperatuer en tafoege oan in foarferwaarme 2 × reaksjemix (cDNA-synthese-hotstart).Dit helpt foar te kommen intermolekulêre basispaaring by lege temperatueren.De meardere temperatuertransysjes dy't nedich binne foar RT-PCR kinne wurde ferienfâldige troch it brûken fan in termyske cycler.

3. Ferminderet genomyske DNA-fersmoarging:

In potinsjele swierrichheid tsjinkaam mei RT-PCR is de kontaminaasje fan genomysk DNA yn it RNA.It brûken fan in goede RNA-isolaasjemetoade, lykas Trizol Reagent, sil de hoemannichte genomysk DNA ferminderje dat de RNA-tarieding kontaminearret.Om produkten ôflaat fan genomysk DNA te foarkommen, kin RNA wurde behannele mei amplifikaasje-graad DNase I om kontaminearjend DNA te ferwiderjen foarôfgeand oan omkearde transkripsje.De DNase I-digestion waard beëinige troch de samples te ynkubearjen yn 2.0 mM EDTA foar 10 minuten by 65 ° C.EDTA kin magnesium-ionen chelate, it foarkommen fan magnesium-ion-ôfhinklike RNA-hydrolyse by hege temperatueren.

Om amplified cDNA te skieden fan kontaminearjende genomyske DNA-amplifikaasjeprodukten, kinne primers wurde ûntworpen dy't elk annealje om exons te skieden.PCR-produkten ôflaat fan cDNA sille koarter wêze dan dy ôflaat fan kontaminearre genomysk DNA.Derneist waard in kontrôle eksperimint sûnder omkearde transkripsje útfierd op elke RNA-sjabloan om te bepalen oft in bepaald fragmint ôflaat wie fan genomysk DNA of cDNA.It PCR-produkt krigen sûnder omkearde transkripsje is ôflaat fan it genom.