• PCR is in metoade dy't brûkt wurdt om DNA te fersterkjen fan in lyts bedrach fan DNA-sjabloan.RT-PCR brûkt omkearde transkripsje om in DNA-sjabloan te produsearjen fan in RNA-boarne dy't dan kin wurde fersterke.
• PCR en RT-PCR binne typysk einpuntreaksjes, wylst qPCR en RT-qPCR de kinetika brûke fan 'e taryf fan produktsynteze tidens de PCR-reaksje om it bedrach fan oanwêzich sjabloan te kwantifisearjen.
• Nijere metoaden, lykas digitale PCR, jouwe absolute kwantifikaasje fan 'e earste DNA-sjabloan, wylst metoaden lykas isothermyske PCR de needsaak foar djoere apparatuer ferminderje om betroubere resultaten te leverjen.

Polymerase chain reaction (PCR) is in relatyf ienfâldige en breed brûkte molekulêre biologyske technyk om DNA- en RNA-sekwinsjes te fersterkjen en te detektearjen.Yn ferliking mei tradisjonele metoaden fan DNA-kloning en amplifikaasje, dy't faak dagen kinne nimme, fereasket PCR mar in pear oeren.PCR is heul gefoelich en fereasket minimale sjabloan foar detectie en amplifikaasje fan spesifike sekwinsjes.Basis PCR-metoaden binne fierder avansearre fan ienfâldige DNA- en RNA-deteksje.Hjirûnder hawwe wy in oersjoch levere fan 'e ferskate PCR-metoaden en de reagentia dy't wy leverje by Enzo Life Sciences foar jo ûndersyksbehoeften.Wy binne fan doel om wittenskippers fluch tagong te krijen ta PCR-reagenzjes om te brûken yn har folgjende ûndersyksprojekt!

PCR

Foar standert PCR is alles wat jo nedich binne in DNA-polymerase, magnesium, nukleotiden, primers, it DNA-sjabloan dat moat wurde fersterke, en in thermocycler.It PCR-meganisme is sa ienfâldich as it doel: 1) dûbelstrenged DNA (dsDNA) is waarmdenaturearre, 2) primers rjochtsje har op 'e inkele DNA-strengen, en 3) de primers wurde útwreide troch DNA-polymerase, wat resulteart yn twa kopyen fan 'e orizjinele DNA strân.It proses fan denaturaasje, annealing en elongaasje oer in searje temperatueren en tiden is bekend as ien syklus fan amplifikaasje (figuer 1).

Elke stap fan 'e syklus moat wurde optimalisearre foar de brûkte sjabloan en primer set.Dizze syklus wurdt sa'n 20-40 kear werhelle, en it fersterke produkt kin dan analysearre wurde, typysk troch agarosegel (figuer 2).

Om't PCR in heul gefoelige metoade is en heul lytse folumes binne nedich foar inkele reaksjes, wurdt de tarieding fan in mastermix foar ferskate reaksjes oanrikkemandearre.De mastermix moat goed mingd wurde en dan ferdield wurde troch it oantal reaksjes, en soargje derfoar dat elke reaksje itselde bedrach fan enzyme, dNTP's en primers sil befetsje.In protte leveransiers, lykas Enzo Life Sciences, biede ek PCR-mixen dy't al alles befetsje útsein primers en it DNA-sjabloan.

Guanine / Cytosine-rike (GC-rike) regio's fertsjintwurdigje in útdaging yn standert PCR-techniken.GC-rike sekwinsjes binne stabiler as sekwinsjes mei legere GC-ynhâld.Fierder tendearje GC-rike sekwinsjes sekundêre struktueren te foarmjen, lykas hierspjeldlussen.As gefolch binne GC-rike dûbele stringen lestich folslein te skieden tidens de denaturaasjefaze.Dêrtroch kin DNA-polymerase de nije strân net sûnder hindering synthesisearje.In hegere denaturation temperatuer kin ferbetterje dit, en oanpassings nei in hegere annealing temperatuer en koartere annealing tiid kin foarkomme de unspecific bining fan GC-rike primers.Oanfoljende reagenzjes kinne de amplifikaasje fan GC-rike sekwinsjes ferbetterje.DMSO, glycerol, en betaine helpe om de sekundêre struktueren te fersteuren dy't wurde feroarsake troch GC-ynteraksjes en fasilitearje dêrmei de skieding fan 'e dûbele stringen.

Hot Start PCR

Unspesifike amplifikaasje is in probleem dat kin foarkomme by PCR.De measte DNA-polymerasen dy't wurde brûkt foar PCR wurkje it bêste by temperatueren om 68 ° C oant 72 ° C.It enzym kin lykwols ek aktyf wêze by legere temperatueren, hoewol yn in legere graad.By temperatueren fier ûnder de annealing temperatuer, primers kinne bine net-spesifyk en liede ta net-spesifike amplification, sels as de reaksje is ynsteld op iis.Dit kin foarkommen wurde troch polymerase-ynhibitoren te brûken dy't allinich dissosiearje fan 'e DNA-polymerase as in bepaalde temperatuer wurdt berikt, fandêr de term hot start PCR.De ynhibitor kin in antykodyk wêze dat de polymerase bynt en denaturearret by de earste denaturaasjetemperatuer (typysk 95 ° C).

High Fidelity Polymerase

Wylst DNA-polymerasen frij sekuer fersterkje nei de orizjinele sjabloansekwinsje, kinne flaters yn nukleotide-oerienkomst foarkomme.Mismatches yn applikaasjes lykas klonen kinne resultearje yn ôfkoarte transkripsjes, en ferkeard oerset as ynaktive aaiwiten streamôfwerts.Om dizze mismatches te foarkommen, binne polymerasen mei in "proofreading" aktiviteit identifisearre en opnommen yn 'e workflow.De earste proofreading polymerase, Pfu, waard identifisearre yn 1991 yn Pyrococcus furiosus.Dit Pfu-enzyme hat in 3' oant 5' exonuklease-aktiviteit.As it DNA wurdt fersterke, ferwideret de exonuklease mismatched nucleotides oan it 3' ein fan 'e strand.It juste nukleotide wurdt dan ferfongen, en DNA-synteze giet troch.De identifikaasje fan ferkearde nukleotide-sekwinsjes is basearre op de binende affiniteit foar it juste nukleosidetrifosfaat mei it enzym, wêrby't ineffisjinte bining de synteze fertraget en de juste ferfanging mooglik makket.De proeflêsaktiviteit fan Pfu-polymerase resulteart yn minder flaters yn 'e definitive folchoarder yn ferliking mei Taq DNA-polymerase.Yn 'e ôfrûne jierren binne oare proofreading-enzymen identifisearre, en modifikaasjes fan it orizjinele Pfu-enzyme binne makke om de flatersifers by DNA-amplifikaasje fierder te ferminderjen.

RT-PCR

Reverse transcription PCR, of RT-PCR, lit it gebrûk fan RNA as sjabloan ta.In ekstra stap lit de deteksje en amplifikaasje fan RNA mooglik meitsje.It RNA wurdt omkeard transkribearre yn komplementêr DNA (cDNA), mei help fan reverse transkriptase.De kwaliteit en suverens fan it RNA-sjabloan binne essensjeel foar it sukses fan RT-PCR.De earste stap fan RT-PCR is de synteze fan in DNA / RNA hybride.Reverse transkriptase hat ek in RNase H-funksje, dy't it RNA-diel fan 'e hybride degradearret.It ienstrengige DNA-molekule wurdt dan foltôge troch de DNA-ôfhinklike DNA-polymerase-aktiviteit fan 'e omkearde transkriptase yn cDNA.De effisjinsje fan 'e earste-string-reaksje kin it amplifikaasjeproses beynfloedzje.Fanôf hjir wurdt de standert PCR-proseduere brûkt om it cDNA te fersterkjen.De mooglikheid om RNA werom te setten yn cDNA troch RT-PCR hat in protte foardielen, en it wurdt primêr brûkt foar analyse fan gen-ekspresje.RNA is ienstrengich en heul ynstabyl, wat it útdaagjend makket om mei te wurkjen.It tsjinnet normaal as in earste stap yn qPCR, dy't RNA-transkrippen yn in biologyske stekproef kwantifisearret.

qPCR en RT-qPCR

Kwantitative PCR (qPCR) wurdt brûkt om nukleïnesoeren te detektearjen, te karakterisearjen en te kwantifisearjen foar ferskate tapassingen.Yn RT-qPCR wurde RNA-transkripten faak kwantifisearre troch se earst yn cDNA omkeard te transkrijen, lykas hjirboppe beskreaun, en dan wurdt qPCR dêrnei útfierd.Lykas yn standert PCR, wurdt DNA fersterke troch trije werheljende stappen: denaturaasje, annealing en ferlinging.Yn qPCR makket fluorescent labeling lykwols it sammeljen fan gegevens mooglik as PCR foarútgiet.Dizze technyk hat in protte foardielen fanwege it oanbod fan metoaden en chemie beskikber.

Yn kleurstof-basearre qPCR (typysk grien), lit fluorescent labeling de kwantifikaasje fan 'e fersterke DNA-molekulen mooglik troch it brûken fan in dsDNA-binende kleurstof.Tidens elke syklus wurdt de fluoreszinsje mjitten.It fluoreszinsjesinjaal nimt proporsjoneel ta it bedrach fan replikearre DNA.Dêrtroch wurdt it DNA yn "echte tiid" kwantifisearre (fig. 3).De neidielen oan kleurstof-basearre qPCR binne dat mar ien doel kin wurde ûndersocht op in tiid en dat de kleurstof sil bine oan alle ds-DNA oanwêzich yn de stekproef.

Yn probe-basearre qPCR kinne in protte doelen tagelyk yn elke stekproef ûntdutsen wurde, mar dit fereasket optimisaasje en ûntwerp fan in doelspesifike probe (s) dy't neist primers brûkt wurde.Ferskate soarten probe-ûntwerpen binne beskikber, mar it meast foarkommende type is in hydrolysesonde, dy't in fluorofoor en quencher omfettet.Fluorescence resonance energy transfer (FRET) foarkomt de útstjit fan 'e fluorofoor fia de quencher wylst de sonde yntakt is.Tidens de PCR-reaksje wurdt de probe lykwols hydrolysearre tidens primer-útwreiding en amplifikaasje fan 'e spesifike sekwinsje dêr't it oan is bûn.De spalting fan 'e sonde skiedt de fluorofoar fan' e quencher en resultearret yn in amplifikaasje-ôfhinklike ferheging fan fluoreszinsje (fig. 4).Sa, it fluorescence sinjaal fan in probe-basearre qPCR reaksje is evenredich mei de hoemannichte fan de sonde doelsekwinsje oanwêzich yn it stekproef.Om't probe-basearre qPCR mear spesifyk is as kleurstof-basearre qPCR, is it faaks de technology dy't brûkt wurdt yn qPCR-basearre diagnostyske assays.

Isotermyske fersterking

De hjirboppe neamde PCR-techniken fereasket djoere thermocycling-apparatuer om de keamertemperatueren sekuer op en del te heljen foar de denaturaasje-, annealing- en útwreidingsstappen.In oantal techniken binne ûntwikkele dy't sokke krekte apparaten net nedich binne en kinne wurde útfierd yn in ienfâldich wetterbad of sels binnen de sellen fan belang.Dizze techniken wurde kollektyf neamd isothermyske amplifikaasje en wurkje basearre op eksponinsjele, lineêre of kaskadefersterking.

It bekendste type isothermyske amplifikaasje is loop-bemiddelde isothermyske amplifikaasje, of LAMP.LAMP brûkt eksponinsjele amplifikaasje by 65⁰C om sjabloan DNA of RNA te fersterkjen.By it útfieren fan LAMP wurde fjouwer oant seis primers komplemintêr oan regio's fan it doel-DNA brûkt mei in DNA-polymerase om nij DNA te synthetisearjen.Twa fan dizze primers hawwe komplemintêre sekwinsjes dy't sekwinsjes yn 'e oare primers werkenne en se bine, wêrtroch't in "loop" struktuer kin foarmje yn it nij synthesisearre DNA dat dan helpt mei primer-annealing yn folgjende rûnen fan amplifikaasje.LAMP kin fisualisearre wurde troch meardere metoaden, ynklusyf fluoreszinsje, agarosegelelektroforese, of kolorimetry.It gemak fan it fisualisearjen en opspoaren fan de oanwêzigens of ôfwêzigens fan produkt troch kolorimetry en it gebrek oan djoere apparatuer dy't nedich is makken LAMP in geskikte opsje foar SARS-CoV-2-testen yn gebieten wêr't klinyske laboratoariumtesten net maklik beskikber wiene, as opslach en ferfier fan samples wie net mooglik, of yn laboratoaren dy't net earder hawwe PCR thermocycling apparatuer.