Yn it iere stadium fan 'e epidemy, fanwegen de rappe ûntwikkeling, is rappe diagnoaze fan fertochte pasjinten de kaai foar it foarkommen fan COVID-19.Guon goedkard nucleic acid detection reagents hawwe in koarte ûntwikkeling tiid, en der binne problemen lykas hastige prestaasjes befêstiging, net genôch reagent optimalisaasje, en grutte ferskillen tusken batches;De problemen fan ferskate klinyske laboratoaria yn ferskate aspekten fan it proses foar deteksje fan nukleïnesoeren kinne ek ynfloed hawwe op 'e krektens fan resultaten foar deteksje fan nukleïnesoeren.Dit artikel sil rjochtsje op 'e wichtige keppelings en punten yn' e hjoeddeistige SARS-CoV-2-nukleïnsûrdeteksje, en analysearje de problemen fan falske negative en positive opnij ûndersiikjen fan laboratoariumnukleïnsûrdeteksje en klinyske ynkonsistinsje.

Prinsipes fan SARS-CoV-2-nukleïnsûrdeteksje

SARS-CoV-2 is in RNA-firus mei in genoomsekwinsje fan sawat 29 kb, mei 10 genen, dy't effektyf 10 proteïnen kinne kodearje.Firussen binne gearstald út RNA en proteïne, en de bûtenste laach is in bûtenste coating gearstald út lipiden en glycoproteins.Binnen wrapt it proteïnekapside it RNA deryn, en beskermet dêrmei it maklik ôfbrekbere RNA (P1).

P1 Struktuer fan SARS-COV-2

Firussen ynfalle sellen fia spesifike sel oerflak receptors te feroarsaakje ynfeksje, en brûke host sellen te replicate.

It prinsipe fan opspoaren fan virale nukleïnesûr is om it virale RNA te bleatsjen fia in sellysaat, en dan real-time fluorescent reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) te brûken foar detectie.

De kaai foar it deteksjeprinsipe is om primers en probes te brûken om "targete matching" te berikken fan nukleïnesûrsekwinsjes, dat is, om de nukleïnesûrsekwinsje fan SARS-CoV-2 te finen dy't oars is fan oare firussen yn sawat 30,000 basen (de oerienkomst fan nukleïnesûr mei oare firussen) "Leech" gebiet), ûntwerpprimers en probes.

De primers en probes binne heul oerienkomme mei de spesifike regio fan SARS-CoV-2-nukleïnesûr, dat is, de spesifisiteit is heul sterk.Sadree't it real-time fluorescent RT-PCR-amplifikaasjeresultaat fan it te testen stekproef posityf is, bewiist it dat SARS-CoV-2 oanwêzich is yn 'e stekproef.sjo p2.

P2-stappen fan SARS-CoV-2-nukleinsûrbepaling (real-time fluorescent RT-PCR)

Betingsten en easken fan laboratoarium foar detectie fan SARS-CoV-2 nukleïnsûr

Laboratoria foar testen foar nukleïnesoeren binne it meast ideaal foar omjouwings mei negative druk, en se moatte omtinken jaan oan drukmonitoring, lucht streamend hâlde en aerosolen eliminearje.Personiel foar testen fan nukleïnesûr moat oerienkommende kwalifikaasjes hawwe, relevante training foar polymeraseketenreaksje krije en de beoardieling trochjaan.It laboratoarium moat strikt wurde beheard, bestimpele yn plak, en irrelevant personiel is strang ferbean om yn te gean.It skjinne gebiet moat op it plak fentilearre en desinfisearre wurde.Relevante items wurde yn sônes pleatst, skjin en smoarch wurde skieden, op tiid ferfongen en op it plak dekontaminearre.Routine desinfectie: Chlor-befette desinfektant is de wichtichste oplossing foar gruttere gebieten, en 75% alkohol kin brûkt wurde foar lytse gebieten.In goede manier om te gean mei aerosolen is it iepenjen fan finsters foar fentilaasje, en lucht desinfectie kin ek wurde útfierd troch middel fan ultraviolet rays, filtraasje, en lucht desinfectie.

Wichtige keppelings en parameters fan SARS-CoV-2-nukleïnsûrbepaling (real-time fluorescent RT-PCR)

Hoewol laboratoaren yn 't algemien goed omtinken jouwe oan "deteksje" fan nukleïnesoer, is yn feite nukleïnesûr "ekstraksje" ek ien fan 'e wichtichste stappen foar suksesfolle opspoaren, dy't nau besibbe is oan it sammeljen en opslaan fan firusmonsters.

Op it stuit brûke de meast brûkte respiratorymonsters, lykas nasopharyngeale swabs, de twadde metoade, dat is in ynaktivaasje (behâld) oplossing taret op basis fan nukleïnesûrekstraksje en lysis-oplossing.Oan 'e iene kant kin dizze oplossing foar behâld fan firus it aaiwyt fan it firus denaturearje, syn aktiviteit ferlieze en net langer besmetlik wêze, en de feiligens fan' e transport- en deteksjestadium ferbetterje;oan 'e oare kant kin it it firus direkt kreakje om it nukleïnesûr frij te litten, it nukleïnesûr-ûntbrekkende enzym te eliminearjen en it firus te foarkommen.It RNA wurdt degradearre.

In firus sampling oplossing taret op basis fan nucleic acid ekstraksje lysis oplossing.De wichtichste komponinten binne lykwichtige sâlten, ethylenediaminetetraacetic acid chelating agent, guanidine sâlt (guanidine isothiocyanate, guanidine hydrochloride, ensfh), anionic surfactant (dodecane) Natrium sulfate), kationic surfactant (tetradecyl trimethyl ammonium oxalate), phenothynoline en oare komponinten ditothreinoil, 8-hydroxyl, phenol, K.Op it stuit binne d'r in protte soarten nukleïnesûr-ekstraksje-kits, en ferskate nukleïnesoere-ekstraksje- en suveringsreagens wurde brûkt.Sels as itselde nukleïnesûr-ekstraksje- en suveringsreagens wurdt brûkt, binne de ekstraksjeprosedueres fan elke kit oars.

Op it stuit binne de produkten foar deteksjekit foar nukleïnezuur goedkard troch de National Medical Products Administration selekteare op basis fan 'e ORF1ab-, E- en N-genen yn it SARS-CoV-2-genoom.De deteksjeprinsipes fan ferskate produkten binne yn prinsipe itselde, mar har primers en probe-ûntwerpen binne oars.D'r binne single-target segminten (ORF1ab), dual-target segminten (ORF1ab, N of E), en trije-target segminten (ORF1ab, N en E).It ferskil tusken opspoaren en ynterpretaasje, nukleïnezuurekstraksje en real-time fluorescent RT-PCR-reaksjesysteem moat ferwize nei de oanbelangjende kitynstruksjes, en it wurdt oanrikkemandearre dat brûkers de ynterpretaasjemetoade strikt folgje dy't spesifisearre is yn 'e kit ynstruksjes foar ynterpretaasje.De mienskiplike regio's, primers en probe-sekwinsjes fersterke troch real-time fluorescent RT-PCR wurde werjûn yn P3.

P3 De lokaasje fan it SARS-CoV-2 amplicon-doel op it genom en de folchoarder fan primers en probes

Ynterpretaasje fan 'e resultaten fan SARS-CoV-2-nukleinsûrbepaling (Real-Time fluorescent RT-PCR)

"Pneumony-previnsje en kontrôleplan foar SARS-CoV-2-ynfeksje (Twadde edysje)" ferdúdlikje foar it earst de kritearia foar it beoardieljen fan de resultaten fan ien-gen-amplifikaasje:

1. Gjin Ct of Ct≥40 is negatyf;

2. Ct<37 is posityf;

3. De Ct wearde fan 37-40 is it griis-skaal gebiet.It is oan te rieden om it eksperimint te werheljen.As it resultaat fan it werjaan fan Ct<40 en de amplifikaasjekromme dúdlike peaks hat, wurdt de stekproef as posityf beoardiele, oars is it negatyf.

De tredde edysje fan de gids en de fjirde edysje fan de gids sette de boppesteande kritearia troch.Fanwegen de ferskate doelen dy't brûkt wurde yn kommersjele kits, joech de boppeneamde 3e edysje fan 'e hantlieding lykwols net de kritearia foar it bepalen fan 'e kombinaasje fan doelen, mei klam op De ynstruksjes levere troch de fabrikant sille prevalearje.Fanôf de fyfde edysje fan de rjochtlinen binne twa doelen dúdlik makke, benammen de oardielkritearia foar ien inkeld doel dat dreech te beoardieljen is.Dat is, as it laboratoarium wol befestigje dat in saak posityf is foar detectie fan SARS-CoV-2 nukleïnesûr, moat oan it folgjende foldien wurde oan 1 fan 2 betingsten:

(1) Twa doelen fan SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) yn deselde stekproef wurde posityf testen troch real-time fluorescent RT-PCR.As ien doel posityf is, binne opnij sampling en opnij testen ferplicht.As de testresultaten binne As it ienige doel noch posityf is, wurdt it beoardiele as posityf.

(2) Twa samples fan real-time fluorescent RT-PCR lieten tagelyk in inkele doel posityf sjen as twa samples fan itselde type lieten in inkeld doel posityf testresultaat sjen, dat kin wurde beoardiele as posityf.De rjochtlinen beklamje lykwols ek dat de negative resultaten fan nukleïnsûrtesten SARS-CoV-2-ynfeksje net kinne útslute.Faktoaren dy't miskien feroarsaakje falske negativen moatte wurde útsletten, ynklusyf minne sample kwaliteit (respiratory samples út oropharynx en oare dielen), sample sammeljen te betiid of te let, Samples waarden net opslein, ferfierd, en ferwurke goed, en de technology sels hie problemen (firus fariaasje, PCR remming), etc.

Oarsaken fan falske negativen yn 'e SARS-CoV-2-deteksje

It konsept fan "falsk negatyf" yn nukleïnesûrtesten dy't op it stuit oanbelanget, ferwiist faaks nei "falske negativen" wêryn de nukleïnsûrtestresultaten ynkonsekwint binne mei klinyske manifestaasjes, dat is, klinyske symptomen en ôfbyldingsresultaten binne tige fertocht fan COVID-19, mar nukleïnesûrtests binne altyd "negatyf" in protte kearen.It Clinical Laboratory Center fan 'e National Health Commission ferklearre de "falsk negative" SARS-CoV-2-test.

(1) D'r is in bepaalde hoemannichte firus yn 'e sellen fan' e ynfekteare persoan.Besteande gegevens litte sjen dat nei't it lichem troch it firus ynfekteare is, it firus yn 'e kiel komt troch de noas en mûle, dan nei de trachea en brongiën, en berikt dan de alveoli.De ynfekteare persoan sil de ynkubaasjeperioade ûnderfine, milde symptomen, en dan it proses fan slimme symptomen, en ferskate stadia fan 'e sykte.En de hoemannichte firus oanwêzich yn ferskate dielen fan it lichem is oars.

Yn termen fan 'e virale lading fan seltypen, alveolêre epitheliale sellen (legere respiratory tract)> airway epithelial sellen (boppeste respiratory tract)> fibroblasts, endothelial sellen, en macrophages, ensfh.út it stekproef type, alveolêre lavage floeistof (de meast Excellent)> djip hoest sputum> nasopharyngeal swab> orofaryngeal swab> bloed.Dêrnjonken kin it firus ek opspoard wurde yn ontlasting.Lykwols, sjoen it gemak fan operaasje en de akseptaasje fan pasjinten, de meast brûkte klinyske monster folchoarder is orofaryngeal swab>nasopharyngeal swab> bronchiale lavage fluid (komplekse operaasje) en djip sputum (meastentiids droege hoest, dreech te krijen).

Dêrom is de hoemannichte firus yn 'e sellen fan' e oropharynx of nasopharynx fan guon pasjinten lyts as ekstreem leech.As allinich samples fan 'e orofarynx of nasopharynx wurde nommen foar testen, sil it virale nukleïnesûr net ûntdutsen wurde.

(2) Gjin firus-befette sellen waarden sammele tidens sample kolleksje, of virale nucleic acid waard net effektyf bewarre bleaun.

[① Unjildich sammelplak, bygelyks by it sammeljen fan orofaryngeale swabs, is de kolleksje djipte net genôch, de sammele nasopharyngeal swabs wurde net djip yn 'e nasale holte sammele, ensfh. De measte sellen sammele kinne firusfrije sellen wêze;

②Sampling swabs wurde ferkeard brûkt.Bygelyks, syntetyske fezels lykas PE fiber, polyester fiber en polypropylene fiber wurde oanrikkemandearre foar it materiaal fan de swab holle.Natuerlike fezels lykas katoen wurde brûkt yn 'e eigentlike operaasje (sterke adsorpsje fan proteïne en net maklik te waskjen) En nylonfezels (slechte wetterabsorption, dy't liedt ta ûnfoldwaande samplingvolumint);

③ Ferkearde gebrûk fan firus opslach buizen, lykas misbrûk fan polypropylene of polyetyleen plestik opslach buizen dy't maklik te absorbearjen nucleic soeren (DNA / RNA), resultearret yn in fermindering fan de konsintraasje fan nucleic soer yn de opslach oplossing.Yn 'e praktyk is it oan te rieden om polyetyleen-propylene polymear plestik en guon spesjaal behannele polypropylene plestik konteners te brûken foar it bewarjen fan virale nukleïnesoeren.]

[① Unjildich sammelplak, bygelyks by it sammeljen fan orofaryngeale swabs, is de kolleksje djipte net genôch, de sammele nasopharyngeal swabs wurde net djip yn 'e nasale holte sammele, ensfh. De measte sellen sammele kinne firusfrije sellen wêze;

②Sampling swabs wurde ferkeard brûkt.Bygelyks, syntetyske fezels lykas PE fiber, polyester fiber en polypropylene fiber wurde oanrikkemandearre foar it materiaal fan de swab holle.Natuerlike fezels lykas katoen wurde brûkt yn 'e eigentlike operaasje (sterke adsorpsje fan proteïne en net maklik te waskjen) En nylonfezels (slechte wetterabsorption, dy't liedt ta ûnfoldwaande samplingvolumint);

③ Ferkearde gebrûk fan firus opslach buizen, lykas misbrûk fan polypropylene of polyetyleen plestik opslach buizen dy't maklik te absorbearjen nucleic soeren (DNA / RNA), resultearret yn in fermindering fan de konsintraasje fan nucleic soer yn de opslach oplossing.Yn 'e praktyk is it oan te rieden om polyetyleen-propylene polymear plestik en guon spesjaal behannele polypropylene plestik konteners te brûken foar it bewarjen fan virale nukleïnesoeren.]

(4) De klinyske laboratoarium operaasje is net standerdisearre.Sampleferfier- en opslachbetingsten, standerdisearre operaasje fan klinyske laboratoaria, resultaatynterpretaasje en kwaliteitskontrôle binne de kaaifaktoaren om de krektens en betrouberens fan testresultaten te garandearjen.Neffens de resultaten fan 'e evaluaasje fan eksterne kwaliteit útfierd troch it Clinical Laboratory Center fan' e National Health Commission op 16-24 maart 2020, fan 'e 844 laboratoaria dy't jildige resultaten krigen, wiene 701 (83.1%) kwalifisearre, en 143 (16.9%) wiene net.Kwalifisearre, de algemiene laboratoariumtestbetingsten binne goed, mar ferskate laboratoaria hawwe noch ferskillen yn personielsoperaasjefeardigens, posityf fermogen foar ynterpretaasje fan single-targets, en kwaliteitskontrôle.

Hoe kinne jo it falske negatyf fan SARS-CoV-2-nukleïnsûrdeteksje ferminderje?

It ferminderjen fan falske negativen yn it opspoaren fan nukleïnesûr moat wurde optimalisearre út 'e fjouwer aspekten fan it produsearjen fan falske negativen.

(1) D'r is in bepaalde hoemannichte firus yn 'e sellen fan' e ynfekteare persoan.De konsintraasje fan it firus yn ferskate dielen fan it lichem fan fertochte ynfekteare persoanen sil op ferskate tiden oars wêze.As der gjin farynx is, kin it wêze yn bronchiale lavagefloeistof of feces.As meardere soarten monsters kinne wurde sammele tagelyk of op ferskillende stadia fan sykteprogression foar testen, Sil helpe foarkomme falske negativen.

(2) Sellen dy't firus befetsje moatte wurde sammele tidens samplesammeling.Dit probleem kin wurde oplost foar in grut part troch it fersterkjen fan de oplieding fan sample samlers.

(3) Betroubere IVD-reagenzjes.Troch ûndersyk út te fieren oer de evaluaasje fan opspoaringsprestaasjes fan reagentia op nasjonaal nivo, en it besprekken fan de besteande problemen, kin de detectie-effisjinsje fan reagenzjes fierder wurde ferbettere en kin de gefoelichheid fan analyse wurde ferbettere.

(4) Standertisearre operaasje fan klinyske laboratoaren.Troch de training fan laboratoariumpersoniel te fersterkjen, it laboratoariumkwaliteitsbehearsysteem kontinu te ferbetterjen, ridlike divyzjes ​​te garandearjen en it fermogen fan personiel om te detectearjen te ferbetterjen, is it mooglik om falske negativen te ferminderjen fanwegen ferkearde laboratoariumoperaasjes.

Redenen foar de opnij test posityf fan SARS-CoV-2 nukleïnesûrtest yn herstelde en ûntslein pasjinten

It "COVID-19 Diagnosis and Treatment Plan (Trial Seventh Edition)" bepaalt dúdlik dat ien fan 'e kritearia foar COVID-19-pasjinten om te genêzen en te ûntslaan út it sikehûs is dat twa opienfolgjende respiratory tract-monsters in negative nukleïnesûrtest hawwe (op syn minst 24 oeren útinoar), mar d'r binne heul min.

(1) SARS-CoV-2 is in nij firus.It is needsaaklik om fierder te begripen syn pathogene meganisme, it folsleine byld fan 'e sykte feroarsake en de skaaimerken fan' e sykte kursus.Dêrom, oan 'e iene kant, is it nedich om te fersterkjen it behear fan ûntslein pasjinten en fieren 14-dagen medyske observaasje.Utfiere follow-up, sûnensmonitoring en sûnensbegelieding om it begryp fan it heule proses fan it foarkommen, ûntwikkeling en resultaat fan 'e sykte te ferdjipjen.

(2) De pasjint kin opnij ynfekteare wurde mei it firus.Academician Zhong Nanshan sei: Om't genêzen pasjinten antykladen hawwe, kin SARS-CoV-2 wurde elimineare troch antykladen as se wer ynfalle.D'r binne in protte redenen, dy't de oarsaak wêze kinne fan 'e herstelde pasjint, of it kin relatearre wêze oan' e mutaasje fan it firus, of sels de oarsaak fan laboratoariumtesten.As it it firus sels is, kin de SARS-CoV-2-mutaasje feroarsaakje dat it antykodym produsearre troch de herstelde pasjint net effektyf is tsjin it mutearre firus.As de pasjint op 'e nij besmet is mei it mutearre firus, kin de nukleïnezuurtest wer posityf wêze.

(3) Wat laboratoariumtestmetoaden oanbelanget, hat elke testmetoade syn beheiningen.SARS-CoV-2-nukleïnsûrdeteksje komt troch de kar fan gensekwinsje, de gearstalling fan reagentia, de gefoelichheid fan 'e metoade en oare redenen, dy't liede ta de besteande kits hawwe har eigen legere deteksjegrinzen.Nei't de pasjint behannele is, nimt it firus yn it lichem ôf.As de virale lading yn it te testen stekproef ûnder de ûnderste limyt fan deteksje is, sil in "negatyf" resultaat ferskine.Dit resultaat betsjut lykwols net dat it firus yn it lichem folslein ferdwûn is.It firus kin wêze neidat de behanneling is stoppe.Resurgence", trochgean te kopiearjen.Dêrom is it oan te rieden om ien kear yn 'e wike te besjen binnen 2 oant 4 wiken nei ûntslach.

(4) Nucleic acid is it genetysk materiaal fan it firus.It firus wurdt fermoarde neidat de pasjint hat ûndergien antivirale behanneling, mar de oerbleaune virale RNA-fragminten wurde noch bewarre bleaun yn it minsklik lichem, en wurde net hielendal ûntslein út it lichem.Soms kin it ûnder bepaalde omstannichheden mear bewarre wurde.In lange tiid, en op dit stuit sil de nukleïnesûrtest "fergonklik" posityf wêze.Mei de ferlinging fan 'e hersteltiid fan' e pasjint, nei't de oerbleaune RNA-fragminten yn it lichem stadichoan útput binne, kin it resultaat fan 'e nukleïnesäure-test negatyf wurde.

(5) It resultaat fan 'e nukleïnsûrtest fan SARS-CoV-2 bewiist allinich de oanwêzigens of ôfwêzigens fan virale RNA, en kin de aktiviteit fan it firus net bewize en oft it firus oerdraachber is.It is needsaaklik om te bewizen oft in pasjint dy't wer in positive nukleïnesoertest hat, wer in boarne fan ynfeksje wurdt.It is needsaaklik om firuskultuer út te fieren op klinyske samples en in "live" firus te kultivearjen om te bewizen dat it besmetlik is.

Gearfetting

Gearfetsjend, SARS-CoV-2-nukleinsûr test falske negativen, retest positive, en oare betingsten dy't net yn oerienstimming binne mei klinyske manifestaasjes kinne net folslein foarkommen wurde.Yn eigentlike screening en testen wurdt it oanrikkemandearre om klinyske symptomen, imaging-ûndersiken (CT) en eksperiminten te kombinearjen.As de testresultaten wurde fûn te wêzen fansels net yn oerienstimming mei de klinyske manifestaasjes, is it oan te rieden om te fieren in wiidweidige analyze fan de hiele test keppeling (sample sammeljen, sirkulaasje en ferwurkjen keppelings) te útslute SARS-CoV-2 firus iere ynfeksje, weromkommende ynfeksje of kombinearre mei oare respiratory firus ynfeksjes, ensfh mooglik.As betingsten it tastean, wurdt it oanrikkemandearre om gefoeligere samples te sammeljen lykas sputum of alveolêre lavagefloeistof foar opnij ûndersyk.

Relatearre produkten:

SARS-CoV-2 Nucleic Acid Detection Kit (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method)