It ferifiearjen fan de prestaasjes fan primers en probes yn it iere stadium fan PCR-reagenzjes en it bepalen fan de meast geskikte reaksjebetingsten binne de betingsten om de glêde fuortgong fan formele eksperiminten te garandearjen.
Dus hoe moatte wy de primerprobe yn it iere stadium befestigje?
De wichtichste yndikatoaren binne baseline, amplification curve, ct wearde, amplification effisjinsje, lege-konsintraasje sample detection, CV, ensfh.
Baseline
De basisline is de horizontale line yn 'e PCR-amplifikaasjekromme.Yn 'e earste pear syklusen fan' e PCR-amplifikaasjereaksje feroaret it fluoreszinsjesinjaal net folle en foarmet in rjochte line.Dizze rjochte line is de basisline.
By it screenen fan PCR-primerprobes, betelje omtinken oan oft de basisline nivo is.De suverens fan 'e konsintraasje fan' e primerprobe sil ynfloed hawwe op 'e basisline, lykas wêrtroch't de basisline opkomt of falle.De basisline is ek in heul yntuïtive yndikator.
Amplification Curve
In oare yntuïtive yndikator is de foarm fan 'e amplifikaasjekromme.It is it bêste om in S-foarmige kromme te hawwen om sekundêre amplifikaasje of oare abnormale amplifikaasjekurven te foarkommen.
Ct wearde
It oantal syklusen dat oerienkomt mei it bûgingspunt fan 'e basisline nei de eksponinsjele groei is de Ct-wearde.
Foar deselde stekproef resultearje ferskate primerprobes yn ferskate amplifikaasjekurven, en de oerienkommende Ct-wearde sil wurde beynfloede troch de amplifikaasje-effisjinsje en ynterferinsjegraad.Yn teory, hoe lytser de Ct-wearde fan 'e primerprobe dy't wy kieze, hoe better.
Amplification Effisjinsje
Ien fan 'e meast betroubere en stabile metoaden foar it evaluearjen fan PCR-amplifikaasje-effisjinsje is de standertkurve, dy't ek breed erkend wurdt troch ûndersikers.De metoade omfettet it meitsjen fan in searje samples om it relatyf oantal doelsjabloanen te kontrolearjen.Dizze samples wurde normaal makke troch seriële ferdunningen fan konsintrearre stockoplossingen, de meast brûkte is 10-fâldige ferwettering.Mei help fan in rige fan verdunde samples, mei help fan standert qPCR programma te amplify te krijen de Cq wearde, en úteinlik tekenje in standert kromme neffens de konsintraasje fan elke stekproef en de oerienkommende Cq wearde te krijen de lineêre fergeliking Cq = -klgX0 + b, en de amplification effisjinsje E = 10 (-1 / k) -1.By it brûken fan qPCR foar kwantitative analyze, is de amplifikaasje-effisjinsje nedich om te wêzen yn it berik fan 90% -110% (3.6> k> 3.1).
Lege konsintraasje Samples Detection
As de monsterkonsintraasje leech is, binne de deteksjeraten fan ferskate primerprobes oars.Wy selektearje 20 samples mei lege konsintraasje om te replikearjen, en it primer-probe-systeem mei de heechste deteksjefrekwinsje is it bêste.
Koëffisjint fan fariaasje (CV)
10 dûbele samples kinne wurde ûntdutsen mei ferskate primerprobes neffens de linestandert fan it reagens foar detectie fan nukleïnezuuramplifikaasje.
Kwantitative reagens:
Krektens
De krektens binnen ien batch moat foldwaan: de fariaasjekoëffisjint (CV,%) fan 'e logaritmyske wearde fan' e testkonsintraasje is ≤5%.As de stekproefkonsintraasje leech is, is de fariaasjekoëffisjint (CV,%) fan 'e logaritme fan 'e deteksjekonsintraasje ≤10%
Kwalitative reagents:
Krektens
De krektens binnen ien batch moat foldwaan oan:
(1) Koëffisjint fan fariaasje fan Ct wearde (CV,%) ≤5%
Itselde stekproef wurdt 10 kear parallel hifke, en de testresultaten moatte konsekwint wêze
Post tiid: Sep-18-2021
