Ik leau dat elkenien altyd sokke of sokke problemen sil tsjinkomme by it dwaan fan PCR-reaksjes, mar de measten fan harren kinne wurde yndield yn twa haadproblemen:

Te min amplifikaasje fan it gen-sjabloan (amplifikaasje);
Tefolle net-doel-gen-amplifikaasje.
It brûken fan tafoegings is ien fan 'e mienskiplike strategyen om dizze problemen op te lossen.Normaal hat de rol fan additieven twa aspekten:
sekundêre struktuerfan genen (sekundêre struktuer);
Ferminderje net-spesifike priming.
Hjoed sil de bewurker jo koart de mienskiplike tafoegings yn PCR-reaksjes en har funksjes yntrodusearje.
Additiven dy't de sekundêre struktuer ferminderje
sulfoxide(DMSO)
gen samplesmei hege GC-ynhâld.DMSO ferminderet lykwols ek Taq-polymerase-aktiviteit sterk.Dêrom moat elkenien de sjabloan tagonklikens en de aktiviteit fan 'e polymerase balansearje.De bewurker suggerearret dat jo ferskate konsintraasjes fan DSMO kinne besykje, lykas fan 2% oant 10%, om de konsintraasje te finen dy't by jo eksperimint past.
Non-ionyske detergenten
Non-ionyske detergenten, lykas 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 of NP-40, ferminderje normaal de sekundêre struktuer fan DNA.Hoewol dit de amplifikaasje fan it sjabloangen ferheegje kin, sil it ek de problemen fan net-spesifike amplifikaasje feroarsaakje.Dat, dizze tafoegings wurkje goed foar PCR-reaksjes mei lege opbringst sûnder pún, mar net sa goed foar relatyf ûnreine PRC-reaksjes.In oar foardiel fan net-ionyske detergenten is it ferminderjen fan SDS-fersmoarging.Meastentiids sil SDS tidens it DNA-ekstraksjeproses nei de PCR-stap brocht wurde, dy't de aktiviteit fan 'e polymerase sterk ynhibeart.Dêrom kin it tafoegjen fan 0,5% Tween-20 of Tween-40 oan 'e reaksje de negative effekten fan SDS neutralisearje.
Betaine_
Betaine kin DNA-amplifikaasje ferbetterje troch de formaasje fan sekundêre struktuer te ferminderjen en is oer it algemien in "mystearje" tafoeging oan kommersjele PCR-kits.As jo ​​wolle brûke betaine, Jo moatte sette betaine of betaine mono-hydrate (Betaine of Betaine mono-hydrate), mar net betaine hydrochloride (Betaine HCl), oanpasse oan in definitive konsintraasje fan 1-1.7M.Betaine kin ek helpe om spesifisiteit te ferbetterjen, om't it de ôfhinklikens fan 'e basispearkomposysje fan DNA-smelten / DNA-denaturaasje elimineert.
Additieven te ferminderjen net-spesifike priming
Formamide
Formamide is in gewoan brûkte organyske PCR-tafoeging.It kin kombinearje mei grutte groove en lytse groove yn DNA, dêrmei it ferminderjen fan de stabiliteit fan de master DNA dûbele helix en ferleget de smelttemperatuer fan DNA.De konsintraasje fan formamide brûkt yn PCR-eksperiminten is normaal 1% -5%.
Tetramethylammoniumchloride( TMAC)
Tetramethylammoniumchloride kin de spesifisiteit fan hybridisaasje (hybridisaasjespesifisiteit) ferheegje en de smelttemperatuer fan DNA ferheegje.Sa kin TMAC net-spesifike priming ferwiderje en misbining fan DNA en RNA ferminderje.As jo ​​brûkedegenerearre primersyn 'e PCR-reaksje, tink om TMAC ta te foegjen, dy't gewoanlik brûkt wurdt by in konsintraasje fan 15-100mM.
Oare mienskiplike tafoegings
Neist de twa hjirboppe neamde kategoryen tafoegings binne d'r in protte mienskiplike tafoegings yn PCR-reaksjes, hoewol se ferskate funksjes hawwe, binne se ek tige wichtich.
Magnesium ion
Magnesiumion is in ûnmisbere kofaktor (kofaktor) fan polymerase, dat wol sizze, sûnder magnesiumion is polymerase ynaktyf.Tefolle magnesiumionen kinne lykwols ek ynfloed hawwe op de effisjinsje fan 'e polymerase.De konsintraasje fan magnesiumionen yn elke PCR-reaksje sil ferskille.Chelaterende aginten (lykas EDTA of citrate), de konsintraasje fan dNTP's en aaiwiten beynfloedzje allegear de konsintraasje fan magnesiumionen.Dus, as jo problemen hawwe mei jo PCR-eksperimint, kinne jo besykje ferskate konsintraasjes fan magnesiumion te feroarjen, bygelyks fan 1.0 nei 4.0mM, mei in ynterval fan 0.5-1mM tusken.
It is de muoite wurdich op te merken dat meardere freeze-thaw-syklusen kinne liede ta konsintraasjestratifikaasje fan 'e oplossing fan magnesiumchloride.Dêrom moatte jo it foar elk gebrûk folslein oplosse, en goed mingje foardat jo it brûke.
Bovine serum albumine(Bovine albumine, BSA)
Yn molekulêre skiekunde eksperiminten, bovine serum albumine is in hiel gewoan tafoeging, benammen yn beheining enzyme spiisfertarring en PCR eksperiminten.Yn PCR-reaksjes is BSA nuttich by it ferminderjen fan kontaminanten lykas fenolyske ferbiningen.En it wurdt ek sein dat it de adhesion fan reactants oan 'e muorre fan' e proefbuis kin ferminderje.Yn 'e PCR-reaksje kin normaal de konsintraasje fan tafoege BSA 0,8 mg / ml berikke.
 
Relatearre produkten:
PCR Hero(mei kleurstof)
PCR Hero