Primer ûntwerpbasis (99% problemen kinne wurde oplost)
1. Primer lingte: It learboek fereasket 15-30bp, meast oer 20bp.De eigentlike betingst is better om 18-24bp te wêzen om de spesifisiteit te garandearjen, mar hoe langer hoe better, te lange primer sil ek de spesifisiteit ferminderje, en de opbringst ferminderje.
2. Primer amplification span: 200-500bp is passend, en it fragmint kin útwreide wurde nei 10kb ûnder spesifike betingsten.
3. Primer basis: De ynhâld fan G + C moat wêze 40-60%, te min G + C amplification effekt is net goed, te folle G + C is maklik te ferskine net-spesifike bands.ATGC wurdt it bêste willekeurich ferspraat, it foarkommen fan klusters fan mear as 5 purine- of pyrimidine-nukleotiden.Multi-gc foar it 5'-ein en tuskensekwinsjes om stabiliteit te ferheegjen, rike GC oan 'e 3'-ein te foarkommen, gjin GC foar de lêste 3-basen, of gjin GC foar 3 fan 'e lêste 5-basen.
4. Avoid sekundêre struktuer yn primers, en mije oanfolling tusken twa primers, benammen oanfolling oan de 3 'ein, oars sil primer dimer wurde foarme en net-spesifike amplified bands wurde oanmakke.
5. De basen oan 'e 3' ein fan primers, benammen de lêste en foarlêste basen, moatte strikt keppele wurde om PCR-falen te foarkommen troch ûnpaarde terminalbasen.
6. Primers hawwe of kinne wurde tafoege mei passende cleavage sites, en de amplifisearre doelsekwinsje moat by foarkar hawwe passende cleavage sites, dat is tige foardielich foar cleavage analyze of molekulêre cloning.
7. Spesifisiteit fan primers: primers moatte gjin dúdlike homology hawwe mei oare sekwinsjes yn 'e nucleic acid sequence databank.
8. Learje om software te brûken: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Dit online ûntwerp wurket bêste).
De boppesteande ynhâld kin op syn minst 99% fan problemen mei primerûntwerp oplosse.
Kontrolearje de details fan primerûntwerp
1. Primer lingte
Algemiene primerlingte is 18 ~ 30 basen.Yn 't algemien is de wichtichste faktor dy't de annealingtemperatuer fan' e primer bepaalt, de lingte fan 'e primer.De annealing temperatuer fan primer wurdt algemien selektearre (Tm wearde -5 ℃), en guon direkt brûke Tm wearde.De folgjende formules kinne brûkt wurde om rûchwei de annealing temperatuer fan primers te berekkenjen.
As de lingte fan primer minder is dan 20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
As de lingte fan primer grutter is as 20bp: 62.3 ℃ + 0.41 ℃ (% GC) -500 / lingte - 5 ℃
Dêrneist kinne in protte software ek brûkt wurde om de annealing temperatuer te berekkenjen, it berekkeningsprinsipe sil oars wêze, dus soms kin de berekkene wearde in lyts gat hawwe.Om PCR-reaksjes te optimalisearjen, wurde de koartste primers dy't soargje foar annealingtemperatueren fan net minder dan 54 ℃ brûkt foar de bêste effisjinsje en spesifisiteit.
Oer it algemien nimt de primerspesifisiteit ta mei in faktor fan fjouwer foar elke ekstra nukleotide, sadat de minimale primerlingte foar de measte tapassingen 18 nukleotide is.De boppegrins fan primer lingte is net hiel wichtich, benammen yn ferbân mei reaksje effisjinsje.Fanwege entropy, hoe langer de primer, de legere de snelheid wêrop it anneals om te binen oan it doel-DNA om in stabile dûbelstrenged sjabloan te foarmjen foar DNA-polymerase om te binen.
By it brûken fan software om primers te ûntwerpen, kin de lingte fan primers op 'e nij wurde bepaald troch TM-wearde, foaral foar primers fan fluorescence kwantitative PCR, TM = 60 ℃ of sa moat wurde kontrolearre.
2.GC ynhâld
Yn 't algemien is de ynhâld fan G + C yn primersekwinsjes 40% ~ 60%, en GC-ynhâld en Tm-wearde fan in pear primers moatte wurde koördinearre.As de primer hat In serieuze GC of AT oanstriid, kin passend bedrach fan A, T of G en C sturt wurde tafoege oan de 5 'ein fan' e primer.
3. Annealing temperatuer
De annealing temperatuer moat wêze 5 ℃ leger as de unchain temperatuer.As it oantal primerbasen lyts is, kin de annealingtemperatuer passend wurde ferhege, wat de spesifisiteit fan PCR kin ferheegje.As it oantal basen grut is, kin de annealingtemperatuer passend wurde ferlege.It annealing temperatuerferskil tusken in pear primers fan 4 ℃ ~ 6 ℃ sil de PCR-opbringst net beynfloedzje, mar ideaal is de annealing-temperatuer fan in pear primers itselde, dat kin fariearje tusken 55 ℃ ~ 75 ℃.
4. Avoid de sekundêre struktuer gebiet fan de amplification template
It is it bêste om de sekundêre struktuerregio fan 'e sjabloan te foarkommen by it selektearjen fan it fersterke fragmint.De stabile sekundêre struktuer fan it doelfragmint kin wurde foarsizze en skatte troch relevante kompjûtersoftware, wat nuttich is foar sjabloan seleksje.Eksperimintele resultaten litte sjen dat de útwreiding faak mislearre is as de frije enerzjy (△G) fan 'e regio dy't útwreide wurde moat minder is dan 58.6lkJ/mol.
5. Mismatch mei doel DNA
As de fersterke doel DNA-sekwinsje grut is, kin in primer bine oan meardere dielen fan it doel-DNA, wat resulteart yn meardere bands dy't yn it resultaat ferskine.Dizze kear is it nedich om de BLAST-softwaretesten, webside te brûken:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Selektearje Twa sekwinsjes rjochtsje (bl2seq).
It plakken fan primer-sekwinsjes nei sône 1 en doel-DNA-sekwinsjes nei sône 2 is útwikselber, en BLAST berekkent komplemintêre, antisense en oare mooglikheden, sadat brûkers net hoege te merken oft beide keatlingen sinketten binne.Jo kinne ek it GI-nûmer ynfiere as jo it GI-nûmer fan 'e folchoarder yn 'e databank kenne, dus jo hoege net in grut diel fan 'e folchoarder te plakjen.As lêste, klikje op Align by 3 om te sjen oft de primer meardere homologe siden hat yn it doel-DNA.
6. Primer terminal
De 3 'ein fan' e primer is wêr't de útwreiding begjint, dus it is wichtich om te foarkommen dat mismatches dêr begjinne.It 3 'ein moat net mear wêze as 3 opfolgjende G of C, om't dit sil feroarsaakje dat de primer fersin yn 'e G+C-ferrikingssekwinsjeregio wurdt trigger.It 3 'ein kin gjin sekundêre struktuer foarmje, útsein yn spesjale PCR (AS-PCR) reaksjes, kin it 3' ein fan 'e primer net oerienkomme.Bygelyks, as de kodearring regio wurdt fersterke, de 3 'ein fan primer moat net wurde beëinige op de tredde posysje fan codon, omdat de tredde posysje fan codon is gefoelich foar degeneraasje, dat sil beynfloedzje de spesifisiteit en effisjinsje fan amplification.By it brûken fan anneksaasjeprimers, ferwize nei de tabel foar gebrûk fan codon, omtinken foar biologyske foarkar, brûk gjin anneksaasjeprimers oan it 3'-ein, en brûk in hegere konsintraasje fan primers (1uM-3uM).
7. Sekundêre struktuer fan primers
De primers sels moatte gjin komplemintêre sekwinsjes hawwe, oars sille de primers sels yn haarspjeldstruktueren foldje, en dizze sekundêre struktuer sil de bining fan primers en sjabloanen beynfloedzje troch steryske hinder.As keunstmjittich oardiel brûkt wurdt, moatte de trochgeande komplementêre basis fan primers sels net grutter wêze as 3bp.D'r moat gjin komplementariteit wêze tusken de twa primers, benammen de komplemintêre oerlaap fan 'e 3' ein moat foarkommen wurde om de formaasje fan primerdimers te foarkommen.Yn 't algemien soe d'r net mear wêze moatte as 4 opfolgjende bases homology as komplementariteit tusken in pear primers.
8. Add markers of loci
It 5 'ein hat net folle effekt op amplifikaasjespesifisiteit en kin dêrom wizige wurde sûnder de amplifikaasjespesifisiteit te beynfloedzjen.De wiziging fan primer 5 'ein opnommen: tafoegjen fan enzyme beheining site;Label biotine, fluorescence, digoxin, Eu3+, ensfh Yntrodusearje protein binding DNA sekwinsjes;Yntrodusearje mutaasje sites, ynfoegje en ûntbrekkende mutaasje sekwinsjes en yntrodusearje promotor sekwinsjes, ensfh De ekstra basen sille mear of minder beynfloedzje de effisjinsje fan amplification en fergrutsje de kâns op primer dimer formaasje, mar guon konsesjes moatte wurde makke foar de folgjende stap.Oanfoljende sekwinsjes dy't net bestean op 'e doelsekwinsje, lykas beheiningsites en promotersekwinsjes, kinne wurde tafoege oan it 5'-ein fan 'e primer sûnder spesifisiteit te beynfloedzjen.Dizze sekwinsjes binne net opnommen yn 'e berekkening fan primer Tm-wearden, mar moatte wurde hifke foar komplementariteit en ynterne sekundêre struktuer.
9. Subclones
Meastentiids is PCR allinich foarriedige klonen, en dan moatte wy it doelfragmint yn ferskate fektors subklone, dus moatte wy ekstra bases ûntwerpe foar de folgjende operaasje yn 'e PCR-stap.
Guon sekwinsjes ûntworpen foar subkloning wurde hjirûnder gearfette.
Restriksje endonuklease beheining site waard tafoege
It tafoegjen fan enzymbeperkingssiden is de meast brûkte metoade foar subklonearjen fan PCR-produkten.Algemien, de cleavage site is seis basen, neist de 5 'ein fan' e cleavage site moatte tafoegje 2 ~ 3 beskermjende bases.It oantal beskermjende basen nedich troch ferskate enzymen is lykwols oars.Bygelyks, SalⅠ fereasket gjin beskermjende basis, EcoRⅤ fereasket 1 beskermjende basis, NotⅠ fereasket 2 beskermjende bases, en Hind Ⅲ fereasket 3 beskermjende bases.
LIC foeget de sturt ta
De folsleine namme fan LIC is Ligation-Independent cloning, in kloningsmetoade útfûn troch Navogen spesifyk foar har diel fan 'e pET-fektor.De pET-drager taret troch LIC-metoade hat net-komplementêre 12-15 basis single strand kleverige einen, dy't de oerienkommende kleverige einen oanfolje op it doelynfoegjefragmint.Foar amplifikaasjedoelen moat de primer 5′-sekwinsje fan it ynfoege fragmint de LIC-fektor oanfolje.De 3′→5′ extranect aktiviteit fan T4 DNA polymerase kin foarmje in inkele strand kleverige ein op it ynfoege fragmint nei in koarte tiid.Omdat it produkt kin allinnich wurde foarme út de ûnderlinge annealing fan de taret ynfoegje fragmint en de vector, dizze metoade is hiel fluch en effisjint, en it is rjochte cloning.
Regissearre TA clone tafoegje sturt
TA-kloning wie net yn steat om it fragmint yn in fektor te rjochtsjen, sadat letter Invitrogen in fektor yntrodusearre dy't klonen koe rjochtsje, dy't fjouwer promininte basis GTGGS oan ien ein befette.Dêrom, yn it ûntwerp fan PCR-primers, moatte komplementêre sekwinsjes dêrmei tafoege wurde, sadat fragminten "oriïntearre" wurde kinne.
As jo koart oan tiid hawwe, kinne jo direkte synteze besykje, it gen te kombinearjen mei de fektor, wat wy ET-gensynteze neame yn musekularisten.
D. In-Fusion cloning metoade
Gjin ligase nedich, gjin lange reaksje nedich.Salang't in sekwinsje oan beide einen fan 'e linearisearre fektor ynfierd wurdt Yn it ûntwerp fan primers, dan wurde it PCR-produkt en de linearisearre fektor tafoege yn' e ynfúzje enzyme-oplossing dy't BSA befettet en in heal oere op keamertemperatuer pleatst, kin de transformaasje útfierd wurde.Dizze metoade is benammen geskikt foar konverzje fan grutte folume.
10. Kombinearje primer
Soms is allinich beheinde folchoarderynformaasje bekend oer primerûntwerp.Bygelyks, as allinich de aminosoersekwinsje bekend is, kin de gearfoegjende primer wurde ûntwurpen.In fúzjeprimer is in mingsel fan ferskate sekwinsjes dy't alle ferskillende basismooglikheden fertsjintwurdigje dy't in inkele aminosoer kodearje.Om spesifisiteit te fergrutsjen, kinne jo ferwize nei de tabel foar codon-gebrûk om anneksaasje te ferminderjen neffens foarkarren foar basisgebrûk fan ferskate organismen.Hypoxanthine kin wurde keppele mei alle basen om de annealingtemperatuer fan 'e primer te ferleegjen.Brûk de anneksearre basen net oan 'e 3'-ein fan 'e primer, om't de annealing fan' e lêste 3-basen oan 'e 3'-ein genôch is om PCR op 'e ferkearde side te begjinnen.Hegere primerkonsintraasjes (1μM oant 3μM) wurde brûkt om't primers yn in protte anneksmingsmingen net spesifyk binne foar it doelsjabloan.
PCR grûnstoffenKontrolearje
1. Primer kwantiteit
De konsintraasje fan elke primer is 0,1 ~ 1umol of 10 ~ 100pmol.It is better om it fereaske resultaat te meitsjen mei it leechste bedrach fan primer.Hege konsintraasje fan primer sil feroarsaakje mismatch en net-spesifike amplification, en fergrutsje de kâns op it foarmjen fan dimers tusken primers.
2. Primer konsintraasje
De konsintraasje fan primers beynfloedet de spesifisiteit.De optimale primerkonsintraasje is oer it generaal tusken 0,1 en 0,5μM.Hegere primerkonsintraasjes liede ta amplifikaasje fan net-spesifike produkten.
3. Annealing temperatuer fan primer
In oare wichtige parameter foar primers is de smelttemperatuer (Tm).Dit is de temperatuer as 50% fan 'e primers en komplementêre sekwinsjes wurde fertsjintwurdige as dûbelstrengige DNA-molekulen.Tm is nedich om PCR annealing temperatuer yn te stellen.Ideaallik is de annealingtemperatuer leech genôch om effektive annealing fan 'e primers te garandearjen mei de doelsekwinsje, mar heech genôch om net-spesifike bining te ferminderjen.Redelijke annealing temperatuer fan 55 ℃ oant 70 ℃.Annealing temperatuer wurdt algemien ynsteld 5 ℃ leger as Tm fan primer.
D'r binne ferskate formules foar it ynstellen fan Tm, dy't sterk ferskille ôfhinklik fan 'e brûkte formule en de folchoarder fan primers.Omdat de measte formules jouwe in skatte Tm wearde, alle annealing temperatueren binne mar in útgongspunt.Spesifisiteit kin wurde ferbettere troch analysearjen fan ferskate reaksjes dy't stadichoan ferheegje de annealing temperatuer.Begjin ûnder de rûsde Tm-5 ℃, en stadichoan fergrutsje de annealing temperatuer yn in tanimming fan 2 ℃.Hegere annealing temperatuer sil ferminderje de formaasje fan primer dimers en net-spesifike produkten.Foar bêste resultaten moatte de twa primers sawat Tm-wearden hawwe.As it Tm-ferskil fan primerpearen mear is dan 5 ℃, sille de primers in signifikante falske start sjen litte troch in legere annealingtemperatuer yn 'e syklus te brûken.As de twa primers Tm oars binne, set de annealing temperatuer op 5 ℃ leger as de leechste Tm.As alternatyf, om spesifisiteit te fergrutsjen, kinne fiif syklusen earst wurde útfierd by annealing temperatueren ûntwurpen foar hegere Tm, folge troch de oerbleaune cycles by annealing temperatueren ûntwurpen foar legere Tm.Dit makket it mooglik in part kopy fan de bestimming sjabloan te krijen ûnder strakke betingsten.
4. Primer suverens en stabiliteit
De standert suverens fan oanpaste primers is adekwaat foar de measte PCR-tapassingen.It fuortheljen fan benzoyl- en isobutylylgroepen troch ûntsalting is minimaal en bemuoit dêrom net mei PCR.Guon applikaasjes fereaskje suvering om gjin sekwinsjes fan folsleine lingte te ferwiderjen yn it syntezeproses.Dizze ôfkoarte sekwinsjes komme foar om't de effisjinsje fan DNA-synthesechemie net 100% is.Dit is in sirkulêr proses dat werhelle gemyske reaksjes brûkt as elke basis wurdt tafoege om DNA te meitsjen fan 3' oant 5'.Jo kinne mislearje yn beide syklus.Langere primers, benammen dy grutter dan 50 basen, hawwe in grut part fan ôfkoarte sekwinsjes en kinne suvering nedich wêze.
De opbringst fan primers wurdt beynfloede troch de effisjinsje fan syntetyske skiekunde en suveringsmetoade.Biofarmaseutyske bedriuwen, lykas Cytology en Shengong, brûke allegear in minimale OD-ienheid om de totale útfier fan oligonucleoside te garandearjen.Oanpaste primers wurde ferstjoerd yn droege poederfoarm.It is it bêste om de primers yn TE opnij op te lossen sadat de definitive konsintraasje 100μM is.TE is better dan deionisearre wetter, om't de pH fan wetter faak soer is en sil de hydrolyse fan oligonucleosiden feroarsaakje.
De stabiliteit fan primers hinget ôf fan opslachbetingsten.Droog poeder en oploste primers moatte wurde opslein by -20 ℃.Primers oplost yn TE by konsintraasjes grutter as 10μM kinne stabyl opslein wurde by -20 ℃ foar 6 moannen, mar kinne allinnich wurde opslein by keamertemperatuer (15 ℃ oant 30 ℃) foar minder dan 1 wike.Drye poederprimers kinne op syn minst 1 jier op -20 C wurde opslein en op keamertemperatuer (15 C oant 30 C) oant 2 moannen.
5. Enzymen en har konsintraasjes
Op it stuit is de brûkte Taq DNA-polymerase yn prinsipe it gen-engineering-enzyme synthesized troch coliform baktearjes.De hoemannichte enzyme nedich om in typyske PCR-reaksje te katalysearjen is sawat 2.5U (ferwiist nei it totale reaksjevolumint fan 100ul).As de konsintraasje te heech is, kin it liede ta net-spesifike amplifikaasje;as de konsintraasje te leech is, wurdt it bedrach fan syntetyske produkt fermindere.
6. Kwaliteit en konsintraasje fan dNTP
De kwaliteit fan dNTP is nau besibbe oan de konsintraasje en de effisjinsje fan PCR-amplifikaasje.It dNTP-poeder is granulêr, en syn fariabiliteit ferliest syn biologyske aktiviteit as it ferkeard opslein is.dNTP-oplossing is soer, en moat brûkt wurde yn hege konsintraasje, mei 1M NaOH of 1M Tris.HCL-bufferoplossing om syn PH oan te passen oan 7.0 ~ 7.5, lyts bedrach fan sub-ferpakking, beferzen opslach by -20 ℃.Meardere freeze-thawing sil dNTP degradearje.Yn PCR-reaksje moat dNTP 50 ~ 200umol/L wêze.Benammen omtinken moat wurde jûn oan 'e konsintraasje fan' e fjouwer DNTPS moat lykweardich wêze (gelyk mole tarieding).As de konsintraasje fan ien fan har oars is fan 'e oaren (heger of leger), sil mismatch wurde feroarsake.Te lege konsintraasje sil de opbringst fan PCR-produkten ferminderje.dNTP kin kombinearje mei Mg2+ en ferminderje de konsintraasje fan frije Mg2+.
7. Template (doelgen) nucleic acid
De hoemannichte en suvering graad fan sjabloan nucleic acid is ien fan de kaai keppelings foar it súkses of mislearjen fan PCR.De tradisjonele DNA-suveringsmetoaden brûke normaal SDS en protease K om eksimplaren te fertarren en te ferwiderjen.De wichtichste funksjes fan SDS binne: it oplossen fan lipiden en aaiwiten op 'e sel membraan, dus ferneatigje de sel membraan troch it oplossen fan membraan aaiwiten, en dissociate nukleêre aaiwiten yn' e sel, SDS kin ek kombinearje mei aaiwiten en precipitate;Protease K kin aaiwiten hydrolysearje en fertarje, benammen histones bûn mei DNA, en dan organysk solvent fenol en chloroform brûke om aaiwiten en oare selkomponinten te ekstrahearjen, en ethanol as isopropylalkohol brûke om nukleïnesûr te foarkommen.It ekstrahearre nucleic acid kin brûkt wurde as sjabloan foar PCR-reaksjes.Foar algemiene klinyske deteksjeeksimplaren kin in rappe en ienfâldige metoade brûkt wurde om sellen op te lossen, patogenen te lysate, aaiwiten te fertarren en te ferwiderjen fan chromosomen nei frije doelgenen, en direkt brûkt foar PCR-amplifikaasje.RNA-template-ekstraksje brûkt meastentiids guanidine-isothiocyanate of protease K-metoade om foar te kommen dat RNase RNA ferneatiget.
8.Mg2+ konsintraasje
Mg2+ hat in signifikant effekt op 'e spesifisiteit en opbringst fan PCR-amplifikaasje.Yn 'e algemiene PCR-reaksje, as de konsintraasje fan ferskate dNTP 200umol/L is, is de passende konsintraasje fan Mg2+ 1.5 ~ 2.0mmol/L.Mg2+ konsintraasje is te heech, de reaksje spesifisiteit nimt ôf, net-spesifike amplification komt foar, te lege konsintraasje sil ferminderje de aktiviteit fan Taq DNA polymerase, resultearret yn de reduksje fan reaksje produkten.
Magnesium-ionen beynfloedzje ferskate aspekten fan PCR, lykas DNA-polymerase-aktiviteit, dy't ynfloed hat op opbringst;In oar foarbyld is primer annealing, dat beynfloedet spesifisiteit.dNTP en sjabloan bine oan magnesiumion, wêrtroch it bedrach fan frije magnesiumion nedich is foar enzymaktiviteit.De optimale magnesiumionkonsintraasje ferskilt foar ferskate primerpearen en sjabloanen, mar in typyske PCR-begjinkonsintraasje mei 200μM dNTP is 1.5mM (note: Foar real-time kwantitative PCR, brûk 3 oant 5mM magnesiumion-oplossing mei in fluorescent probe).Hegere konsintraasjes fan frije magnesium-ionen ferheegje de opbringst, mar ferheegje ek net-spesifike amplifikaasje en ferminderje de trou.Om de optimale konsintraasje te bepalen, waarden magnesiumiontitraasjes útfierd yn stappen fan 0.5mM fan 1mM oant 3mM.Om de ôfhinklikens fan magnesiumion-optimisaasje te ferminderjen, kin Platinum Taq DNA-polymerase brûkt wurde.Platina Taq DNA polymerase is by steat om te behâlden funksje oer in breder skala oan magnesium ion konsintraasjes dan Taq DNA polymerase en dêrom fereasket minder optimalisaasje.
9. Pcr-befoarderjen tafoegings
Optimalisaasje fan annealing temperatuer, primer design, en magnesium ion konsintraasje is genôch foar tige spesifike amplification fan de measte sjabloanen;lykwols, guon sjabloanen, ynklusyf dy mei hege GC ynhâld, fereaskje ekstra maatregels.Additiven dy't de smelttemperatuer fan DNA beynfloedzje, jouwe in oare manier om produktspesifisiteit en opbringst te ferbetterjen.Folsleine denaturaasje fan it sjabloan is nedich foar bêste resultaten.
Derneist foarkomt de sekundêre struktuer primerbinding en enzyme-útwreiding.
PCR-tafoegings, ynklusyf formamide, DMSO, glycerine, betaine, en PCRx Enhancer Solution, ferbetterje amplifikaasje.Har mooglike meganisme is om de smelttemperatuer te ferleegjen, sadwaande de annealing fan primers te helpen en DNA-polymerase-útwreiding te helpen troch de sekundêre struktuerregio.PCRx Solution hat oare foardielen.Minimale magnesiumion-optimalisaasje is fereaske as brûkt mei Platinum Taq DNA-polymerase en Platinum Pfx DNA-polymerase.Sa wurdt de Platinum-technyk kombinearre mei it additief om spesifisiteit te ferheegjen, wylst de ôfhinklikens fan 'e tredde oanpak, magnesiumion-optimisaasje, wurdt fermindere.Foar bêste resultaten moat de konsintraasje fan tafoegings optimalisearre wurde, benammen DMSO, formamide, en glycerol, dy't Taq DNA-polymerase remme.
10. Hot start
Hot start PCR is ien fan de meast wichtige metoaden te ferbetterjen PCR spesifisiteit neist goede primer design.Hoewol de optimale elongaasjetemperatuer fan Taq DNA-polymerase 72 ℃ is, bliuwt de polymerase aktyf by keamertemperatuer.Sa wurde net-spesifike produkten produsearre as de holdingtemperatuer leger is dan de annealingtemperatuer tidens de tarieding fan 'e PCR-reaksje en oan it begjin fan' e termyske syklus.Ienris foarme, wurde dizze net-spesifike produkten effektyf fersterke.Hot-start PCR is benammen effektyf as de siden dy't brûkt wurde foar primerûntwerp wurde beheind troch de lokaasje fan genetyske eleminten, lykas site-rjochte mutaasjes, ekspresjekloning, of konstruksje en manipulaasje fan genetyske eleminten brûkt foar DNA-technyk.
In mienskiplike metoade om de aktiviteit fan Taq DNA-polymerase te beheinen is om PCR-reaksje-oplossing op iis te meitsjen en it yn in foarferwaarme PCR-apparaat te pleatsen.Dizze metoade is ienfâldich en goedkeap, mar it foltôget de aktiviteit fan it enzym net en eliminearret dêrom de amplifikaasje fan net-spesifike produkten net folslein.
Termyske priming fertraget DNA-synteze troch in essensjele komponint te remmen oant it PCR-apparaat denaturaasjetemperatuer berikt.De measte manuele metoaden foar termyske inisjaasje, ynklusyf fertrage tafoeging fan Taq DNA-polymerase, binne omslachtich, foaral foar applikaasjes mei hege trochset.Oare metoaden foar termyske priming brûke in waaksskyld om in essensjele komponint te befetsjen, ynklusyf magnesiumionen of enzymen, of om reaktive komponinten fysyk te isolearjen, lykas sjabloanen en buffers.Tidens de termyske syklus wurde de ferskate komponinten frijlitten en meiinoar mingd as de waaks smelt.Lykas de manuele hjittestartmetoade is de waaksskermmetoade omslachtich en gefoelich foar fersmoarging en is net geskikt foar applikaasjes mei hege trochset.
Platina DNA polymerase is handich en effisjint foar automatyske hot start PCR.Platinum Taq DNA-polymerase bestiet út rekombinante Taq DNA-polymerase kombinearre mei monoklonaal antykodyk tsjin Taq DNA-polymerase.De antykladen wurde formulearre troch PCR om enzymaktiviteit te remmen by langere temperatuerhâlden.Taq DNA-polymerase waard frijlitten yn 'e reaksje tidens de isolaasje fan 94 ℃ fan' e denaturaasjestap, en herstelde folsleine polymerase-aktiviteit.Yn tsjinstelling ta gemysk modifisearre Taq DNA-polymerase foar thermyske inisjatyf, hat Platinum-enzyme gjin langere isolaasje nedich by 94 ℃ (10 oant 15 minuten) om de polymerase te aktivearjen.Mei PlatinumTaq DNA-polymerase waard 90% fan Taq DNA-polymerase-aktiviteit restaurearre nei 2 minuten by 94 ℃.
11. Nest-PCR
Opfolgjende rûnen fan amplifikaasje mei help fan nestele primers kinne spesifisiteit en gefoelichheid ferbetterje.De earste omloop is in standert fersterking fan 15 oant 20 syklusen.In lytse fraksje fan it earste amplifikaasjeprodukt waard 100 oant 1000 kear verdund en tafoege oan 'e twadde ronde fan amplifikaasje foar 15 oant 20 syklusen.As alternatyf kin it inisjele fersterke produkt berekkene wurde troch gelreiniging.In nestele primer wurdt brûkt yn 'e twadde ronde fan amplifikaasje, dy't kin bine oan de doelsekwinsje binnen de earste primer.It gebrûk fan nestele PCR ferleget de mooglikheid fan amplifikaasje fan meardere doelsites, om't d'r in pear doelsekwinsjes binne komplemintêr foar beide sets primers.Itselde totale oantal syklusen (30 oant 40) mei deselde primers fersterke de net-spesifike plakken.Nested PCR fergruttet de gefoelichheid fan beheinde doelsekwinsjes (bgl. seldsume mrnas) en ferbetteret de spesifisiteit fan dreech PCRS (bgl. 5' RACE).
12. Descending PCR
Descending PCR ferbetteret spesifisiteit troch it brûken fan strakke annealing betingsten foar de earste pear syklusen fan PCR.De syklus begjint by in annealing temperatuer likernôch 5 ℃ heger as de skatte Tm, dan elke syklus wurdt fermindere troch 1 ℃ nei 2 ℃ oant de annealing temperatuer is ûnder Tm 5 ℃.Allinich it bestimmingssjabloan mei de heechste homology sil wurde fersterke.Dizze produkten bliuwend útwreidzje yn folgjende syklusen, en ferpleatse de fersterke net-spesifike produkten.Descending PCR is nuttich foar metoaden wêr't de graad fan homology tusken primer en doelsjabloan net bekend is, lykas AFLP DNA fingerprinting.
Related PCR Kits
De 2× PCR HeroTMMix systeem hat hegere tolerânsje foar PCR inhibitors as de gewoane PCR Mix systeem, en kin maklik omgean mei PCR amplification fan ferskate komplekse sjabloanen.It unike reaksjesysteem en hege-effisjinsje Taq Hero meitsje dat de PCR-reaksje hegere amplifikaasje-effisjinsje, spesifisiteit en gefoelichheid hat.
Hegere amplification effisjinsje
It hat 5'→3' DNA polymerase aktiviteit en 5'→3' exonuclease aktiviteit, sûnder 3'→5' exonuclease aktiviteit.
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Spesifike-optimisearre buffer en hot-start Taq-enzyme kinne net-spesifike amplifikaasje en formaasje fan primerdimer foarkomme
Hege gefoelichheid - kin detect lege kopyen fan sjabloan
De kit brûkt in unyk Foregene reverse transcription reagens en Foregene HotStar Taq DNA Polymerase kombineare mei in unyk reaksjesysteem om de amplifikaasje-effisjinsje en spesifisiteit fan 'e reaksje effektyf te ferbetterjen.
Post tiid: mei-09-2023
