Yn qPCR-eksperiminten is primerûntwerp ek in heul wichtige keppeling.Oft de primers geskikt binne of net is nau besibbe oan oft de amplifikaasje-effisjinsje de standert berikt, oft de fersterke produkten spesifyk binne, en oft de eksperimintele resultaten beskikber binne.
Dus hoe kinne jo qPCR-primerspesifisiteit better meitsje?Hege amplification effisjinsje?
Hjoed sille wy jo nimme om tegearre qPCR-primers te ûntwerpen, en lit qPCR-primerûntwerp in effisjinte lorefeardigens wurde yn eksperiminten.
By it ûntwerpen fan qPCR-primers, betelje meastentiids omtinken foar de folgjende punten: primers moatte wurde ûntwurpen oer introns safolle mooglik, it produkt lingte moat wêze 100-300 bp, de Tm wearde moat wêze sa ticht mooglik by 60 ° C, en de streamop en streamôfwerts primers moatte wêze sa ticht mooglik, en de ein fan 'e primer moat wêze wachtsjen of C, ensfh.
1. Untwerp fan primers spanning yntrons
By it ûntwerpen fan qPCR-primers, kin it kiezen fan primers ûntworpen oer introns foarkomme dat it gDNA-sjabloan wurdt fersterke, en de produkten binne allegear ôflaat fan 'e amplifikaasje fan cDNA, sadat de ynfloed fan gDNA-fersmoarging elimineert.
2. Primer lingte
De primerlingte is oer it generaal tusken 18-30 nt, en de lingte fan it amplifikaasjeprodukt moat safolle mooglik kontrolearre wurde tusken 100-300 bp.
As de primer te koart is, sil it liede ta net-spesifike amplifikaasje, en as it te lang is, sil it maklik sekundêre struktuer foarmje (lykas haarspjeldstruktuer).As de amplification produkt is te lang, it is net geskikt foar de reaksje fan polymerase, dat sil beynfloedzje de effisjinsje fan PCR amplification.
3. GC ynhâld en Tm wearde
De GC-ynhâld fan primers moat kontrolearre wurde tusken 40% en 60%.As it te heech of te leech is, is it net befoarderlik om de reaksje te begjinnen.De GC-ynhâld fan 'e foarút- en reverse-primers moat tichtby itselde wêze om deselde Tm-wearde en annealingtemperatuer te krijen.
De Tm-wearde moat sa fier mooglik tusken de 55-65°C lizze, oer it generaal om de 60°C hinne, en de Tm-wearde fan de streamop- en streamôfwerts moat sa ticht mooglik wêze, leafst net mear as 4°C.
4. Mije selektearjen A oan de 3 'ein fan' e primer
As it 3 'ein fan' e primer net oerienkomt, binne d'r grutte ferskillen yn 'e synteze-effisjinsje fan ferskate basen.As de lêste basis A is, kin it ek ketensynteze begjinne, sels yn it gefal fan mismatching, en as de lêste basis T When is, wurdt de effisjinsje fan mismatchinduksje sterk fermindere.Besykje dêrom te foarkommen dat jo A kieze oan 'e 3'-ein fan' e primer, en it is better om T te kiezen.
As it in probe-primer is, kin it 5′-ein fan 'e sonde net G wêze, om't sels as in inkele G-basis ferbûn is mei de FAM-fluorescent-reportergroep, kin G ek it fluorescent sinjaal útstutsen troch de FAM-groep ôfbrekke, wat resulteart yn falske negative resultaten.Skine.
5. Basis ferdieling
De ferdieling fan 'e fjouwer basen yn' e primer is by foarkar willekeurich, it foarkommen fan mear as 3 opfolgjende G of C oan 'e 3' ein, en mear as 3 opfolgjendeG of C binne maklik te generearjen pairing yn de GC-rike folchoarder regio.
6. It primerûntwerpgebiet moat komplekse sekundêre struktueren foarkomme.
De sekundêre struktuer foarme troch de ienige strân fan it amplifikaasjeprodukt sil ynfloed hawwe op de glêde foarútgong fan PCR.Troch te foarsizzen oft der in sekundêre struktuer is yn 'e doelsekwinsje fan tefoaren, besykje dizze regio te foarkommen yn it ûntwerp fan primers.
7. De primers sels en tusken de primers moatte besykje opfolgjende komplementêre basen te foarkommen.
D'r kin gjin opienfolgjende 4-basiskomplementariteit wêze tusken de primer sels en de primer.De primer sels moat gjin komplemintêre folchoarder hawwe, oars sil it himsels foldje om in haarspjeldstruktuer te foarmjen, dy't de annealingkombinaasje fan 'e primer en it sjabloan beynfloedzje.
Komplementêre sekwinsjes kinne net bestean tusken streamop en streamôfwerts primers.Komplementariteit tusken primers sil primerdimers produsearje, wat PCR-effisjinsje sil ferminderje en sels kwantitative krektens beynfloedzje.As de primer-dimer- en haarspjeldstruktueren net te ûntkommen binne, moat de △G-wearde net te heech wêze (moat minder dan 4,5 kcal / mol wêze).
8. De primers fersterkje it doelspesifike produkt.
It ultime doel fan qPCR-deteksje is om de oerfloed fan it doelgen te begripen.As net-spesifike amplifikaasje optreedt, sil de kwantifikaasje unakkuraat wêze.Dêrom, neidat de primers binne ûntwurpen, se moatte wurde hifke troch BLAST, en de spesifisiteit fan 'e produkten wurdt fergelike yn' e folchoarder databank.
Dêrnei nimme wy it minsklike GAS6 (Growth arrest specific 6) gen as foarbyld om qPCR-primers te ûntwerpen.
01 query gen
Homo GAS6fia NCBI.Hjir moatte wy omtinken jaan oan it fergelykjen fan de gennamme en soarten om te soargjen dat se konsekwint binne.
02 Fyn de gensekwinsje
(1) As de doelsekwinsje genomysk DNA is, selektearje dan de earste, dat is de genomyske DNA-sekwinsje fan it gen.
(2) As de doelsekwinsje mRNA is, selektearje dan de twadde.Nei it ynfieren klikje jo op "CDS" yn 'e tabel hjirûnder.De brune eftergrûnsekwinsje is de kodearjende folchoarder fan it gen.
03 Design primers
Fier de Primer-BLAST ynterface yn
Fier it gen folchoarder nûmer of de folchoarder yn Fasta formaat op de boppeste lofts, en folje de relevante parameters.

Klikje op "Get primers" en NCBI sil ferskine om jo te fertellen dat sa'n parameter seleksje sil wurde fersterke nei oare splicing farianten.Wy kinne de ferskate splitsingsfarianten kontrolearje en se yntsjinje om it passende primerpaar te krijen (lykas werjûn yn 'e ôfbylding hjirûnder).Dit proses kin tsientallen sekonden duorje om te rinnen.
De annealing temperatueren fan dizze primer pearen binne allegear om 60 ° C.Neffens it doel fan it eksperimint, kieze primers mei matige lingte, goede spesifisiteit en minder selskomplemintaasje fan 'e primers foar it eksperimint, en it súksesrate is frij heech!
04Primer spesifisiteit ferifikaasje
Yn feite, neist it ûntwerpen fan primers, kin Primer-Blast ek de primers evaluearje dy't wy sels ûntworpen hawwe.Werom nei de primer design side, Fier de streamop en streamôfwerts primers wy ûntwurpen, en oare parameters wurde net oanpast.Nei it yntsjinjen kinne jo sjen oft it pear primers ek bestiet op oare genen.As se allegear wurde werjûn op it gen dat wy wolle fersterkje, wat oanjout dat de spesifisiteit fan dit pear primers geweldig is!(Dit is bygelyks it ienige resultaat fan 'e primer-query!)

05 Primer kwaliteit oardiel
Hokker soarte primer is de "perfekte" primer dy't "amplifikaasje-effisjinsje oant standert", "fersterke produkteigenskippen" en "betroubere eksperimintele resultaten" kombineart?
Amplification effisjinsje

melting kromme
De amplifikaasje-effisjinsje fan 'e primers berikt 90% -110%, wat betsjut dat de amplifikaasje-effisjinsje goed is, en de smeltkurve hat in inkele peak en meastentiids Tm> 80 ° C, wat betsjut dat de amplifikaasje-spesifisiteit goed is.
 
Relatearre produkten:
Real Time PCR Easy–SYBR GREEN I
Real Time PCR Easy-Taqman