Molekulêre diagnoazetechnology brûkt molekulêre biologyske metoaden om de ekspresje en struktuer fan it genetysk materiaal fan it minsklik lichem en ferskate patogenen te detektearjen, om it doel te berikken fan it foarsizzen en diagnoaze fan sykten.

Yn 'e ôfrûne jierren, mei de opwurdearring en iteraasje fan molekulêre diagnostyske technology, is de klinyske tapassing fan molekulêre diagnoaze mear en mear wiidweidich en yngeand wurden, en de molekulêre diagnostykmerk is in perioade fan rappe ûntwikkeling yngien.

De auteur vat de mienskiplike molekulêre diagnostyske technologyen op 'e merke gear, en is ferdield yn trije dielen: it earste diel yntrodusearret de PCR-technology, it twadde diel yntrodusearret de technology foar isothermyske amplifikaasje fan nukleïnsûr, en it twadde diel yntroduseart de technology foar sequencing.

01

Diel I: PCR Technology

PCR technology

PCR (polymerase chain reaction) is ien fan 'e in vitro DNA-amplifikaasjetechnologyen, mei in skiednis fan mear dan 30 jier.

PCR-technology waard yn 1983 pionierd troch Kary Mullis fan Cetus, FS.Mullis hat yn 1985 in PCR-patint oanfrege en publisearre yn itselde jier it earste PCR akademysk papier oer Wittenskip.Mullis wûn yn 1993 de Nobelpriis foar Skiekunde.

Basisprinsipes fan PCR

PCR kin doel-DNA-fragminten mear dan ien miljoen kear fersterkje.It prinsipe is dat ûnder de katalysis fan DNA-polymerase, de âlderstreng DNA wurdt brûkt as sjabloan, en in spesifike primer wurdt brûkt as útgongspunt foar útwreiding.It wurdt replikearre in vitro troch stappen lykas denaturaasje, annealing, en útwreiding.It proses fan dochterstreng DNA komplemintêr oan 'e âlderstreng template DNA.

It standert PCR-proses is ferdield yn trije stappen:

1. Denaturation: Brûk hege temperatuer te skieden DNA dûbele stringen.De wetterstofbânen tusken DNA dûbele stringen wurde brutsen by hege temperatueren (93-98 ° C).

2. Annealing: Nei't it dûbelstrengige DNA skieden is, wurdt de temperatuer ferlege, sadat de primer kin bine oan it ienstrengige DNA.

3. Utwreiding: De DNA polymerase begjint te synthesize komplementêre stringen lâns de DNA stringen fan de primers bûn as de temperatuer wurdt ferlege.As de útwreiding is foltôge, wurdt in syklus foltôge, en it oantal DNA-fragminten ferdûbelet.

Troch dizze trije stappen 25-35 kear werom te reitsjen, sil it oantal DNA-fragminten eksponentiell tanimme.

De fernimstigens fan PCR is dat ferskate primers kinne wurde ûntwurpen foar ferskate doelgenen, sadat de doelgenfragminten yn in koarte perioade kinne wurde fersterke.

Oant no kin PCR wurde ferdield yn trije kategoryen, nammentlik gewoane PCR, fluorescent kwantitative PCR en digitale PCR.

De earste generaasje fan gewoane PCR

Brûk in gewoane PCR-amplifikaasjeynstrumint om it doelgen te fersterkjen, en brûk dan agarosegelelektroforese om it produkt te detektearjen, allinich kwalitative analyse kin dien wurde.

De wichtichste neidielen fan 'e earste generaasje PCR:

-Foar net-spesifike amplifikaasje en falsk positive resultaten.

-De deteksje duorret in lange tiid en de operaasje is omslachtig.

-Allinich kwalitative testen kinne dien wurde.

Twadde-generaasje fluorescence kwantitative PCR

Fluorescence kwantitative PCR (Real-Time PCR), ek wol bekend as qPCR, wurdt brûkt om tafersjoch te hâlden de accumulation fan amplified produkten troch de accumulation fan fluorescent sinjalen troch taheakjen fan fluorescent sondes dy't kinne oanjaan de fuortgong fan de reaksje systeem, en te oardieljen de resultaten troch de fluorescence kromme, en It kin wurde kwantifisearre mei de standert curve wearde en help fan kromme wearde.

Om't de qPCR-technology wurdt útfierd yn in sletten systeem, wurdt de kâns op fersmoarging fermindere, en kin it fluoreszinsjesinjaal kontroleare wurde foar kwantitative deteksje, dus it is it meast brûkt yn klinyske praktyk en is de dominante technology yn PCR wurden.

De fluorescent stoffen brûkt yn real-time fluorescent kwantitative PCR kinne wurde ferdield yn: TaqMan fluorescent probes, molekulêre beacons en fluorescent kleurstoffen.

1) TaqMan fluorescent sonde:

Tidens PCR-amplifikaasje wurdt in spesifike fluorescent probe tafoege by it tafoegjen fan in pear primers.De sonde is in oligonukleotide, en de twa úteinen binne respektivelik markearre mei in reporter fluorescent groep en in quencher fluorescent groep.

As de sonde yntakt is, wurdt it fluorescent sinjaal útstjoerd troch de reportergroep opnomd troch de quenching-groep;tidens PCR amplification, de 5'-3' exonuclease aktiviteit fan Taq enzyme cleaves en degradearret de sonde, wêrtroch't de reporter fluorescerende groep en quencher De fluorescent groep wurdt skieden, sadat de fluorescence tafersjochsysteem kin ûntfange it fluorescence sinjaal, dat is, eltse kear in DNA-strân wurdt opboud fluorescent en fluorescent, fluorescent en fluorescent cence sinjaal is folslein syngronisearre mei de foarming fan de PCR produkt.

2) SYBR fluorescerende kleurstoffen:

Yn it PCR-reaksjesysteem wurdt in oerskot fan SYBR-fluorescent kleurstof tafoege.Nei't de SYBR fluorescent kleurstof net-spesifyk is opnommen yn 'e DNA-dûbelstring, stjoert it in fluorescent sinjaal út.De SYBR-fervemolekule dy't net yn 'e keten opnommen is, sil gjin fluorescent sinjaal útstjoere, en soarget dêrmei foar it fluorescent sinjaal De ferheging fan PCR-produkten is folslein syngronisearre mei de ferheging fan PCR-produkten.SYBR bynt allinnich oan dûbel-stringed DNA, sadat de smeltkurve kin brûkt wurde om te bepalen oft de PCR-reaksje spesifyk is.

3) Molekulêre beakens

It is in stam-lus dûbel-labele oligonucleotide probe dy't in haarspjeldstruktuer foarmet fan sawat 8 basen oan 'e 5 en 3 einen.De nukleïnesoere-sekwinsjes oan beide úteinen binne komplementêr keppele, wêrtroch't de fluorescent groep en de quenching-groep strak binne.Slút, it sil gjin fluoreszinsje produsearje.

Nei it generearjen fan it PCR-produkt, tidens it annealingproses, wurdt it middelste diel fan 'e molekulêre beaken keppele mei in spesifike DNA-sekwinsje, en it fluorescent gen wurdt skieden fan it quencher-gen om fluoreszinsje te produsearjen.

De wichtichste neidielen fan twadde generaasje PCR:

Gefoelichheid ûntbrekt noch, en de opspoaring fan eksimplaren mei leech kopy is net krekt.

Der is eftergrûn wearde ynfloed, en it resultaat is gefoelich foar ynterferinsje.

Tredde generaasje digitale PCR

Digitale PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) berekkent it kopynûmer fan 'e doelsekwinsje troch einpuntdeteksje, en kin krekte absolute kwantitative deteksje útfiere sûnder ynterne kontrôles en standertkurven te brûken.

Digitale PCR brûkt einpuntdeteksje en is net ôfhinklik fan 'e Ct-wearde (syklusdrompel), sadat de digitale PCR-reaksje minder beynfloede wurdt troch de amplifikaasje-effisjinsje, en de tolerânsje foar PCR-reaksje-ynhibitoren wurdt ferbettere, mei hege krektens en reprodusearberens.

Troch de skaaimerken fan hege gefoelichheid en hege krektens, wurdt it net maklik bemuoid troch PCR-reaksje-ynhibitoren, en kin it wiere absolute kwantifikaasje berikke sûnder standertprodukten, dy't in ûndersyks- en tapassing hotspot wurden is.

Neffens de ferskillende foarmen fan de reaksje ienheid, it kin wurde ferdield yn trije soarten: microfluidic, chip en droplet systemen.