Foarsprong

Lang net-kodearjend RNA, lncRNA is in net-kodearjend RNA mei in lingte grutter dan 200 nukleotiden, yn 't algemien tusken 200-100000 nt.lncRNA regulearret gen-ekspresje op epigenetyske, transkripsje- en post-transkripsje-nivo's, en docht mei oan X-chromosoom-silencing, genome-ymprinting en chromatine-modifikaasje, transkripsje-aktivearring, transkripsje-ynterferinsje, nukleêr ferfier, selsyklusregeling, seldifferinsjaasjeregeling, en dosiskompensaasje-effekten, en in protte oare wichtige oare kompensaasje-effekten foar te kommen en te foarkommen. ion fan minsklike sykten, en binne op it stuit ien fan 'e hot spots op it mêd fan biomedicine.

01  Soarten en skaaimerken fan LncRNA

lncRNA is ferdield yn in protte soarten neffens de ferskate boarnen fan syn formaasje, lykas werjûn yn 'e figuer hjirboppe.Hat de folgjende skaaimerken:

1. lncRNAs binne meastal langer, mei dynamyske ekspresje en ferskillende splicing metoaden by differinsjaasje
2. Yn ferliking mei kodearjende genen hat lncRNA meastentiids in legere ekspresjenivo
3. De measte lncRNAs hawwe dúdlik tydlike en romtlike ekspresje spesifisiteit yn it proses fan weefsel differinsjaasje en ûntwikkeling
4. Der binne karakteristike útdrukkingen yn tumors en oare sykten
5. De subcellulêre lokaasjes fan lncRNA binne ferskaat
6. De folchoarder is leech yn behâld, mar de funksje hat in bepaalde graad fan behâld, etc.

02 Faak stelde fragen oer LncRNA reverse transkripsje

Troch de lege ynhâld fan lncRNA yn sellen, lange lingte en hege-nivo struktuer, sa'n RNA hat faak komplekse struktueren lykas stam loops of haarspelden, en RT-qPCR is gefoelich foar problemen fan net slagge omkearde transkripsje of lege effisjinsje.

03 LncRNA reverse transcription oplossing

Yn 'e sintrale regel wurdt it proses fan RNA-firussen dy't har eigen omkearde transkriptase brûke om DNA te syntetisearjen mei RNA as sjabloan, omkearde transkripsje neamd.It proses fan it brûken fan RNA-firus reverse transkriptase om cDNA-sjabloanen yn vitro te syntetisearjen wurdt omkearde transkripsje neamd.De wichtichste eleminten opnommen yn it omkearde transkripsjesysteem: RNA-sjabloan, omkearde transkriptase, primers en oare komponinten.

1.RNA template

De ynfloed fan RNA-sjabloan op omkearde transkripsje wurdt wjerspegele yn syn struktuer, suverens en yntegriteit.Hoe heger de suverens en yntegriteit fan it ekstrahearre RNA, hoe heger de effisjinsje fan omkearde transkripsje en hoe krekter de folgjende kwantitative resultaten.It RNA suvere troch gewoan brûkte RNA-ekstraksje-reagenzjes befettet faak residuen fan alkohol en guanidine-sâlten, dy't in sterk remmende effekt hawwe op de measte omkearde transkriptase.

2.Reverse transkriptase

Omkearde transkriptase hat in wichtige ynfloed yn it heule omkearde transkripsjesysteem.De geskikte temperatuer foar de reverse transkriptase brûkt yn de measte laboratoaria is oer it generaal 42 ° C.Yn feite fereasket de iepening fan 'e RNA-struktuer op hege nivo in hegere temperatuer, en de easken foar de omkearde transkriptase binne heger.

3.Primer

Omkearde transkripsjeprimers omfetsje gen-spesifike primers, willekeurige primers en Oligo dT-primers.De measte lncRNA's befetsje gjin polyA-sturten, en it is wichtich om de willekeurige primers goed te passen mei Oligo dT.

4.Oare komponinten

Mei it each op it feit dat RNA benammen maklik te degradearjen is, kin de ynfiering fan komponinten yn it omkearde transkripsjesysteem minimalisearre wurde, wat de ynfier fan RNase effektyf kin foarkomme en de glêde foarútgong fan omkearde transkripsje garandearje.

Foregenekrijt út RNA template, reverse transkripsje nei qPCR

Begeliede jo lncRNA-deteksje wiidweidich

Dieren totaal RNA IsolationKit (mei kolom foar gDNA-ferwidering)

Seltotaal RNA IsolationKit (mei kolom foar gDNA-ferwidering)

Lnc-RT HeroTM I (Mei gDNase) (Super Premix foar earste-string cDNA synteze fan lncRNA)

Real Time PCR EasyTM-SYBR Green I

Afoardielen ofRNA-ekstraksje:

De kit brûkt de tredde-generaasje RNA-ekstraksjetechnology, gjin needsaak om DNase te brûken.

11 minuten fan 96, 24, 12, en 6-well plaat kweekte sellen, hege effisjinsje ekstraksje fan gDNA-frije, hege suverens, heechweardich totale sel RNA.

Foardielen fan lncRNA reverse transkripsje:

In omkear-transkripsjesysteem spesjaal ûntwikkele foar LncRNA om genomyske DNA-fersmoarging fluch te ferwiderjen.

It omkearde transkripsjesysteem hat hege thermyske stabiliteit en hat noch altyd goede reverse-transkripsjeprestaasjes by 50 °C.

Sjabloanen mei hege GC ynhâld en komplekse sekundêre struktuer kinne wurde omkeard mei hege effisjinsje.

Foardielenof qPCR:

Hot start Foregene Taq Polymerase hat hegere amplification effisjinsje, hegere amplification gefoelichheid, en hegere amplification spesifisiteit

De optimalisearre Real PCR Easy Mix makket SYBR Green I in hegere deteksje-sensitiviteit, en syn fluorescence-yntensiteit is 3-5 kear dy fan ferlykbere produkten, dy't kinne foldwaan oan 'e behoeften fan ferskate soarten fluorescence kwantitative eksperiminten.