Ct wearde is de meast wichtige resultaat presintaasje foarm fan fluorescent kwantitative PCR.It wurdt brûkt om gene ekspresje ferskillen of gen kopy nûmer te berekkenjen.Dus wat wurdt de Ct-wearde fan fluorescence-kwantifikaasje as ridlik beskôge?Hoe kinne jo it effektive berik fan Ct-wearde garandearje?

Wat is Ct-wearde?
Tidens it qPCR-amplifikaasjeproses is it oerienkommende oantal amplifikaasjesyklusen (Cycle Threshold) as it fluoreszenssinjaal fan it fersterke produkt de ynstelde fluoreszensjedrompel berikt.C stiet foar Cycle en T stiet foar Threshold.Simply sette, de Ct wearde is it oantal syklusen oerienkommende mei doe't de earste sjabloan amplification berikt in bepaald bedrach fan produkt yn qPCR.De saneamde "in bepaalde hoemannichte produkt" sil letter fierder útlein wurde.

Wat docht de Ct-wearde?

1.Relaasje tusken eksponinsjele amplification, malbelopet en Ct wearde
Ideaallik wurde genen yn qPCR opboud troch eksponinsjele amplifikaasje nei in bepaald oantal syklusen.De relaasje tusken it oantal amplification syklusen en it bedrach fan produkten is: Amplified produkt bedrach = initial template bedrach × (1 + En) cycles number.De qPCR-reaksje is lykwols net altyd yn in ideale situaasje.As it bedrach fan fersterke produkt in "bepaalde produktbedrach" berikt, is it oantal syklusen op dit stuit de Ct-wearde, en it is yn 'e eksponinsjele amplifikaasjeperioade.De relaasje tusken de Ct wearde en it bedrach fan begjinnende sjabloan: Der is in lineêre relaasje tusken de Ct wearde fan it sjabloan en de logaritme fan it begjinpunt kopy nûmer fan it sjabloan.De hegere de earste sjabloan konsintraasje, wat lytser de Ct wearde;de legere de earste template konsintraasje, de grutter de Ct wearde.

2.Amplification curve, fluorescence drompel en bepaalde PCR produkt bedrach
De hoemannichte qPCR-amplifikaasjeprodukt wurdt direkt presintearre yn 'e foarm fan fluorescent sinjaal, dat is de amplifikaasjekromme.Yn it iere stadium fan PCR is de amplifikaasje ûnder ideale omstannichheden, it oantal syklusen is lyts, de produktakkumulaasje is lyts, en it nivo fan fluoreszinsje kin net dúdlik wurde ûnderskieden fan 'e fluoreszenseftergrûn.Dêrnei nimt de fluoreszinsje ta en komt de eksponinsjele faze yn.De hoemannichte PCR-produkt kin op in bepaald punt ûntdutsen wurde as de PCR-reaksje krekt yn 'e eksponinsjele faze is, dat kin brûkt wurde as "in beskaat bedrach fan produkt", en de earste ynhâld fan it sjabloan kin hjirút ôflaat wurde.Dêrom is de yntensiteit fan fluorescinsjesinjaal dy't oerienkomt mei in bepaalde hoemannichte produkt de fluoreszensjedrompel.

Yn 'e lette etappe fan PCR toant de amplifikaasjekromme net mear eksponinsjele amplifikaasje, en komt de lineêre faze en plateaufaze yn.

3.Reproducibility fan Ct wearden
As de PCR-syklus it syklusnûmer fan 'e Ct-wearde berikt, is it krekt de wirklike eksponinsjele amplifikaasjeperioade ynfierd.Op dit stuit is de lytse flater net fersterke, sadat de reprodusearberens fan 'e Ct-wearde poerbêst is, dat is itselde sjabloan wurdt fersterke op ferskate tiden of yn ferskate buizen tagelyk.Amplification, de krigen Ct wearde is konstant.

1.Amplification effisjinsje En
PCR-amplifikaasje-effisjinsje ferwiist nei de effisjinsje wêrmei't de polymerase it te fersterkjen gen omsette yn in amplicon.De amplifikaasje-effisjinsje as ien DNA-molekule wurdt omfoarme ta twa DNA-molekulen is 100%.Amplifikaasje-effisjinsje wurdt faak útdrukt as En.Om de analyze fan folgjende artikels te fasilitearjen, wurde de faktoaren dy't de amplifikaasje-effisjinsje beynfloedzje koart yntrodusearre.

2.Range fan Ct wearden
Ct wearden fariearje fan 15-35.As de Ct-wearde minder is dan 15, wurdt beskôge dat de amplifikaasje binnen it berik fan 'e basislineperioade is en de fluoreszensdrompel is net berikt.Ideal is d'r in lineêre relaasje tusken de Ct-wearde en de logaritme fan it earste kopynûmer fan it sjabloan, dat is de standertkromme.Troch de standert kromme, as de amplifikaasje-effisjinsje is 100%, is de berekkene Ct-wearde foar it kwantifisearjen fan it inkele kopynûmer fan it gen om 35. As it grutter is as 35, is it earste kopynûmer fan 'e sjabloan teoretysk minder as 1, wat kin wurde beskôge as sinleas.

Foar ferskate gen Ct-beriken, troch it ferskil yn gen-kopynûmer en amplifikaasje-effisjinsje yn 'e earste sjabloanbedrach, is it nedich om in standertkromme foar it gen te meitsjen en it lineêre deteksjeberik fan it gen te berekkenjen.

3.Influencing faktoaren fan Ct wearde
Ut de relaasje tusken it oantal amplification syklusen en it bedrach fan produkt: bedrach fan fersterke produkt = bedrach fan initial template × (1 + En) syklus number, kin sjoen wurde dat ûnder ideale omstannichheden, it bedrach fan initial sjabloan en En sil hawwe in negative ynfloed op Ct wearde wurdt beynfloede.It ferskil yn sjabloan kwaliteit of amplification effisjinsje sil feroarsaakje de Ct wearde te grut of te lyts.

4.Ct wearde is te grut of te lyts