PCR is de meast brûkte technology foar amplifikaasje fan nukleïnesoeren en wurdt in protte brûkt fanwegen syn gefoelichheid en spesifisiteit.PCR fereasket lykwols werhelle termyske denaturaasje en kin de beheiningen net kwytreitsje fan it fertrouwen op ynstruminten en apparatuer, wat syn tapassing yn klinyske fjildtesten beheint.

Sûnt de iere jierren 1990, in protte laboratoaria binne begûn te ûntwikkeljen konstante temperatuer amplification technology dy't net nedich thermyske denaturation.No hawwe se loop-bemiddelde isothermyske amplifikaasjetechnology ûntwikkele, isothermyske amplifikaasjetechnology foar strânferfanging, isothermyske amplifikaasjetechnology foar rollende sirkels, en ôfhinklikens fan nukleïnsûrsekwinsje.Isothermyske amplifikaasjetechnology en oare technologyen. 

Loop-mediated isothermyske amplifikaasje

It amplifikaasjeprinsipe is basearre op it feit dat DNA by sa'n 65 °C yn in dynamyske lykwichtsstân is.As elke primer base-paar is en útwreide nei it komplemintêre diel fan dûbelstrenged DNA, sil de oare strân dissoziearje en ienstrengich wurde.

By dizze temperatuer brûkt DNA 4 spesifike primers om te fertrouwen op in strand-ferpleatsing DNA-polymerase om de synteze fan strand-ferpleatsing DNA kontinu te sirkulearjen.

Bepale earst de 6 spesifike regio's F3, F2, F1, B1, B2, B3 op it doelgen, en ûntwerp dan 4 primers basearre op dizze 6 spesifike regio's (lykas werjûn yn 'e figuer hjirûnder):

De foarút binnenste primer (FIP) is gearstald út F1c en F2.

De efterút ynderlike primer (BIP) is gearstald út B1c en B2, en TTTT wurdt brûkt as spacer yn 'e midden.

De bûtenste primers F3 en B3 binne respektivelik gearstald út F3- en B3-regio's op it doelgen.

Yn it LAMP-reaksjesysteem is de konsintraasje fan 'e binnenste primer ferskate kearen dy fan' e bûtenste primer.De ynderlike primer wurdt earst kombinearre mei de sjabloanstreng om in komplemintêre strân te synthesisearjen om in DNA-dûbele strân te foarmjen.Dêrnei wurdt de bûtenste primer kombinearre mei de sjabloanstreng om in DNA-dûbele strân te foarmjen.Under de aksje fan BstDNA-polymerase wurdt de komplemintêre strân synthesisearre troch de ynderlike primer frijlitten.Nei in searje reaksjes foarmet de komplementêre strân úteinlik in inkele DNA-strân mei in dumbbell-struktuer.

De dumbbell struktuer DNA single strand sels wurdt brûkt as sjabloan om kontinu foarmje in oergong stam-loop struktuer DNA mei in iepen ein.De ynderlike en bûtenste primers begeliede it DNA fan 'e transysjonele stam-lusstruktuer om kontinu te ûndergean strandferpleatsing en -útwreidingsreaksjes, en foarmje úteinlik meardere stam-loopstruktueren mei ferskate lingten.DNA mingsel.

Foardielen en neidielen fan loop-mediated isothermyske amplification

Foardielen fan LAMP:

(1) Hege amplifikaasje-effisjinsje, dy't effektyf 1-10 kopyen fan it doelgen binnen 1h kin fersterkje, en de amplifikaasje-effisjinsje is 10-100 kear dat fan gewoane PCR.

(2) De reaksjetiid is koart, de spesifisiteit is sterk, en gjin spesjale apparatuer is nedich.

Tekortkomingen fan LAMP:

(1) De easken foar primers binne benammen heech.

(2) It amplified produkt kin net brûkt wurde foar cloning en sequencing, mar kin allinnich brûkt wurde foar oardiel.

(3) Troch syn sterke gefoelichheid is it maklik om aerosolen te foarmjen, wêrtroch't falske positiven feroarsaakje en de testresultaten beynfloedzje.

Strand ferpleatsing amplification

Strand displacement amplification (SDA) is in in vitro isothermyske DNA-amplifikaasjetechnyk basearre op enzymatyske reaksje foar it earst foarsteld troch Amerikaanske gelearde Walker yn 1992.

It basissysteem fan SDA omfettet in beheining endonuklease, in DNA-polymerase mei strânferpleatsingsaktiviteit, twa pearen primers, dNTP's, en kalsium- en magnesiumionen en buffersystemen.

It prinsipe fan amplifikaasje fan strânferpleatsing is basearre op 'e gemysk modifisearre beheining endonuklease-erkenningsekwinsje oan beide úteinen fan it doel-DNA.De endonuklease iepenet de gat yn 'e strân DNA op syn erkenning site, en de DNA polymerase wreidet de gat 3' End en ferfange de folgjende DNA strand.

De ferfongen inkele stringen fan DNA kinne wurde kombinearre mei primers en útwreide yn dûbele stringen troch DNA polymerase.Dit proses wurdt kontinu werhelle, sadat de doelsekwinsje effisjint wurdt fersterke.

Foardielen en neidielen fan strand ferpleatsing amplification technology

Foardielen fan SDA:

De amplifikaasje-effisjinsje is heech, de reaksjetiid is koart, de spesifisiteit is sterk, en gjin spesjale apparatuer is nedich.

Tekortkomingen fan SDA:

De produkten binne net unifoarm, en guon single-stranded en double-stranded produkten wurde altyd produsearre yn de SDA syklus, en tailing sil ûnûntkomber foarkomme as ûntdutsen troch electrophoresis.

Rolling sirkel amplification

Rolling Circle Amplification (RCA) wurdt foarsteld troch te tekenjen op 'e metoade foar it kopiearjen fan DNA fan pathogene organismen troch rollende sirkel.It ferwiist nei it gebrûk fan single-stringed sirkulêre DNA as sjabloan by in konstante temperatuer, en in spesjale DNA polymerase (lykas Phi29) ) Under de aksje fan rolling sirkel DNA synteze te berikken de amplification fan it doel gen.

RCA kin wurde ferdield yn lineêre amplification en eksponinsjele amplification.De effisjinsje fan lineêre RCA kin 10 berikke⁵kearen, en de effisjinsje fan eksponinsjele RCA kin 10 berikke⁹kear.

Ienfâldige ûnderskieding, lykas werjûn yn 'e ûndersteande figuer, lineêre amplifikaasje a brûkt allinich 1 primer, eksponinsjele amplifikaasje b hat 2 primers.

Lineêre RCA wurdt ek wol single primer RCA neamd.In primer bindet oan sirkulêr DNA en wurdt útwreide troch de aksje fan DNA-polymerase.It produkt is in lineêre single strand mei in grut oantal repetitive sekwinsjes tûzenen kearen de lingte fan in inkele loop.

Sûnt it produkt fan lineêre RCA is altyd ferbûn mei de startprimer, is de maklike fixaasje fan it sinjaal in grut foardiel.

Eksponinsjele RCA, ek bekend as Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA), yn eksponinsjele RCA, ien primer fersterket de RCA produkt, de twadde primer hybridizes mei de RCA produkt en wreidet út, en de ferfanging is al bûn oan de RCA produkt De streamôfwerts primers ferlingje de strân, en werhelje útwreiding en ferfanging te produsearje in dendritic produkt.

De foardielen en neidielen fan rôljende sirkel nucleic acid amplification

Foardielen fan RCA:

Hege gefoelichheid, goede spesifisiteit en maklike operaasje.

Tekortkomingen fan RCA:

Eftergrûnproblemen by sinjaaldeteksje.Tidens de RCA-reaksje kinne de net-sirkuleare hangslotsonde en it sjabloan-DNA of RNA fan 'e net-bûne sonde wat eftergrûnsinjalen generearje. 

Nucleicacid sequence-basearre amplification

Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) is in nije technology ûntwikkele op basis fan PCR.It is in trochgeande en isotermyske nukleïnesûr-amplifikaasje begelaat troch in pear primers mei in T7-promotorsekwinsje.De technology kin it sjabloan RNA fersterkje mei sawat 109 kear yn sawat 2 oeren, dat is 1000 kear heger as de konvinsjonele PCR-metoade en hat gjin spesjale apparatuer nedich.

Dizze technology is brûkt foar rappe diagnoaze fan sykten sa gau as it ferskynde, en in protte bedriuwen brûke dizze metoade op it stuit yn RNA-deteksjekits.

Hoewol RNA-amplifikaasje ek kin brûke omkearde transkripsje PCR-technology, NASBA hat syn eigen foardielen: it kin wurde útfierd ûnder relatyf konstante temperatueromstannichheden, en it is stabiler en krekter dan tradisjonele PCR-technology.

De reaksje is by 41 graden Celsius en fereasket AMV (avian myeloblastosis firus) reverse transkriptase, RNase H, T7 RNA polymerase en in pear primers om te foltôgjen.

It proses omfettet benammen:

De foarút primer befettet de komplementêre folchoarder fan 'e T7-promotor.Tidens de reaksje bindet de foarút primer oan 'e RNA-strân en wurdt katalysearre troch it AMV-enzyme om in DNA-RNA-dûbele strân te foarmjen.

RNase H fertaret it RNA yn 'e hybride dûbelstreng en behâldt it ienstrengige DNA.

Under de aksje fan 'e omkearde primer en it AMV-enzyme wurdt in DNA-dûbele strân foarme mei de T7-promotorsekwinsje.

Under de aksje fan T7 RNA-polymerase wurdt it transkripsjeproses foltôge en wurdt in grutte hoemannichte doel-RNA produsearre.

Foardielen fan NASBA:

(1) Syn primer hat in T7 promoter folchoarder, mar de frjemde dûbele-stranded DNA hat gjin T7 promoter folchoarder en kin net wurde fersterke, dus dizze technology hat hege spesifisiteit en gefoelichheid.

(2) NASBA omfettet it omkearde transkripsjeproses direkt yn 'e amplifikaasjereaksje, en ferkoartet de reaksjetiid.

Neidielen fan NASBA:

(1) De reaksjekomponinten binne komplisearre.

(2) Trije soarten enzymen binne nedich om de reaksjekosten heger te meitsjen.