RT-qPCR is de basis eksperimint fan molekulêre biology, en elkenien moat wêze bekend mei it.It omfettet foaral trije stappen: RNA-ekstraksje, omkearde transkripsje yn cDNA, en real-time fluorescent kwantitative PCR.It helpt net, wat bart der?It is wierskynlik dat der in probleem meiit omkearde transkripsje eksperimint!Hoewol it liket dat it eksperimint mei omkearde transkripsje allinich RNA, dNTP, primers enreverse transkriptasenei de centrifuge buis en mix goed, mar yn 'e eigentlike operaasje proses, der binne noch in protte details dy't moatte wurde betelle omtinken oan.Litte wy der oer leare!

Hoe kinne jo de kwaliteit fan RNA beoardielje?
Om cDNA te krijen is de kwaliteit fan RNA kritysk!RNA-kwaliteit kin benammen wurde ûntdutsen út twa aspekten:
(1) RNA-yntegriteit:RNA-yntegriteit kin wurde ferifiearre troch agarosegelelektroforese. Troch eukaryoten as foarbyld te nimmen, hat it folsleine totale RNA trije dúdlike bands, de molekulêre gewichten fan grut oant lyts binne 28S, 18S en 5S, en 28S is twa kear sa helder as 18S;as trije bands kin sjoen wurde, ma de band type is wazig of Diffusion betsjut dat de RNA wurdt foar in part degradearre.Fier op dit stuit de omkearde transkripsjereaksje fuortendaliks út en ferheegje de sjabloanynfier passend;as allinich in band mei in lyts molekulêr gewicht of gjin band kin wurde sjoen, is it RNA folslein degradearre en moat it opnij ekstrahearre wurde.Agilent 2100 jout de yntegriteit fan RNA oan mei peakdiagram en RIN-wearde.As it nukleïnesoer yntakt is, is de basisline fan it elektroferogram flak;as de nucleic soer is slim degradearre, de baseline is uneven en mear degradaasje peaks ferskine;de wearde fan RIN wjerspegelet de yntegriteit fan it RNA, binnen it berik fan 0-10, hoe grutter de wearde, hoe better de kwaliteit fan it RNA.No, hoe heger de graad fan folsleinens.
(2) Reinheid fan RNA:De ferhâlding fan OD260/280 kin wurde ûntdutsen troch UV-spektrofotometry.As de ferhâlding fan OD260/280 tusken 1,9 en 2,1 is, is de suverens tige goed.
Residual genomysk DNA kin liede ta ûnkrekte kwantitative resultaten
As RNA ekstrahearre wurdt, kin it RNA dat wy krije mingd wurde mei genomysk DNA (gDNA) dat net is skjinmakke.Dêrom sil it cDNA nei omkearde transkripsje ek wurde mingd meigDNA.Tidens de streamôfwertsqPCRreaksje,cDNAen gDNA kin tagelyk wurde fersterke, wat resulteart yn in relatyf lytse CT-wearde, sadat de resultaten miskien wêze kinne.
Dus wat moatte wy dwaan yn dizze situaasje?Foarigesuggerearret:
(1) Utfiere genoomreiniging op 'e omkearde RNA, dat kin wurde fuortsmiten troch kolomekstraksje by RNA-ekstraksje;
(2) Behannelje it ekstrahearre RNA mei DNaseI , mar beëinigje it mei EDTA;
fan reverse transkripsje reagentsmei genome clearing modules;

Hoe kinne primers kieze foar reverse transkripsje?
Omkearde transkripsjeprimers beynfloedzje ek de útkomst fan 'e omkearde transkripsjereaksje.Jo kinne willekeurige primers, Oligo dT of gen-spesifike primers kieze foar omkearde transkripsje neffens de spesifike omstannichheden fan it eksperimint:
(1) Spesifike transkripsjes: gen-spesifike primers wurde oanrikkemandearre;
(2) Lange fragminten transkripsjes: Oligo dT / gene-spesifike primers wurde oanrikkemandearre;
(3) Ynterne fragminten fan transkripten mei lange segminten: gene-spesifike primers / willekeurige primers / willekeurige primers + Oligo dT.As it folgjende qPCR-eksperimint wurdt útfierd, kin Oligo dT net allinich brûkt wurde, om't it brûken fan Oligo dT allinich 3 'ein bias kin feroarsaakje, wat liedt ta ûnkrekt qPCR-eksperimintresultaten;
(4) miRNA: Stem-loop primers of tailing primers kinne brûkt wurde.

Hoefolle kearen moat it omkearde transkripsjeprodukt cDNA wurde verdund foar kwantifikaasje?
Nei it krijen fan it cDNA fan it omkearde transkripsjeprodukt, hoefolle kearen it cDNA moat wurde verdund foar qPCR-eksperiminten is heul wichtich.As de cDNA-konsintraasje te heech of te leech is, kin de amplifikaasje-effisjinsje beynfloede wurde.Kin de cDNA-konsintraasje mjitten wurde, en hoe moat it dien wurde?
(1) De cDNA-konsintraasje fan it produkt fan omkearde transkripsje kin net mjitten wurde, om't njonken it cDNA-produkt it produkt fan 'e omkearde transkripsje ek omkearde transkripsjeresidualbuffer, omkearde transkriptase, primers, ensfh.Op dit stuit sille guon freonen sizze, dan sil ik nei suvering de konsintraasje mjitte;hjir, Foregene soe graach ûnthâlde dat it cDNA wurdt net oan te rieden om te wurde suvere, omdat de lingte fan de cDNA krigen troch de omkearing is oars, en de koarte cDNA sil ferlern gean yn de suvering.
(2) Dus wat te dwaan?Foardat it qPCR-eksperimint kin de verdunningsgradient fan 'e cDNA wurde bepaald troch it pre-eksperimint.Bygelyks: brûk cDNA-stock-oplossing, 10-fold-dilution, en 100-fold-dilution as sjabloanen foar qPCR-eksperiminten, en selektearje de verdunningsfaktor mei in CT-wearde yn it berik fan 18-28.

Hoe moatte miRNA's reverse transkribearre wurde?
miRNA is in single-stringed lyts molekule RNA mei in grutte fan likernôch 22 nt dat net koade foar proteïne.Fanwege syn koarte lingte, konvinsjonele qPCR metoade is dreech om direkt kwantifisearje it, dus it is faak nedich om te wreidzjen miRNA;de meast brûkte metoaden foar reverse transkripsje foar miRNA omfetsje stem-loop metoade en tailing metoade.
De stem-loop-metoade is om it miRNA út te wreidzjen troch stem-loop-primers ta te foegjen.Dizze deteksjemetoade hat hegere gefoelichheid en spesifisiteit, mar de deteksjetrochfier is leech.Ien omkearde transkripsje kin mar ien miRNA en in ynterne referinsje detektearje;de sturt-tafoeging metoade is gearstald út twa It wurdt foltôge troch de mienskiplike aksje fan twa enzymen, dat binne PolyA polymerase en reverse transkriptase.PolyA-polymerase is ferantwurdlik foar it tafoegjen fan PolyA-sturten oan miRNA om syn lingte te fergrutsjen, en omkearde transkriptase fiert omkearde transkripsjereaksje.Dizze metoade hat hege deteksje-trochput en kin meardere miRNA's en ynterne referinsjes detektearje yn ien omkearde transkripsje, mar de gefoelichheid en spesifisiteit binne leech yn 'e stem-loop-metoade.