PCR (polymerase chain reaction) is ien fan 'e in-vitro DNA-amplifikaasjetechnologyen, mei in skiednis fan mear dan 30 jier.

PCR-technology waard pionierd troch Kary Mullis fan Cetus, USA yn 1983. Mullis hat yn 1985 in PCR-patint oanfrege en publisearre yn datselde jier it earste PCR akademysk papier oer Wittenskip.Mullis waard yn 1993 de Nobelpriis foar skiekunde takend foar syn wurk.

Basisprinsipes fan PCR

PCR kin doel-DNA-fragminten mear dan ien miljoen kear fersterkje.It prinsipe is ûnder de katalyse fan DNA-polymerase, mei help fan âlderstreng DNA as sjabloan en spesifike primer as útgongspunt foar útwreiding.It wurdt replikearre in vitro troch stappen lykas denaturaasje, annealing, en útwreiding.It proses fan dochterstreng DNA komplemintêr oan 'e âlderstreng template DNA.

It standert PCR-proses is ferdield yn trije stappen:

1.Denaturaasje: Brûk hege temperatuer om DNA dûbele stringen te skieden.De wetterstofbân tusken DNA dûbele stringen wurdt brutsen by hege temperatuer (93-98 ℃).

2.Annealing: Nei't it dûbelstrengige DNA skieden is, ferleegje de temperatuer sadat de primer kin bine oan it single-stringed DNA.

3.Extension: De DNA-polymerase begjint komplementêre stringen lâns de DNA-strengen te synthesearjen fan 'e primers bûn as de temperatuer ferlege wurdt.As de útwreiding is foltôge, wurdt in syklus foltôge, en it oantal DNA-fragminten ferdûbelet

Troch dizze trije stappen 25-35 kear werom te reitsjen, sil it oantal DNA-fragminten eksponentiell tanimme.

De fernimstigens fan PCR is dat ferskate primers kinne wurde ûntwurpen foar ferskate doelgenen, sadat doelgenfragminten yn in koarte perioade kinne wurde fersterke.

Oant no kin PCR wurde ferdield yn trije kategoryen, nammentlik gewoane PCR, fluorescent kwantitative PCR en digitale PCR.

De earste generaasje fan gewoane PCR

Brûk in gewoane PCR-amplifikaasjeynstrumint om it doelgen te fersterkjen, en brûk dan agarosegelelektroforese om it produkt te detektearjen, allinich kwalitative analyse kin dien wurde.

De wichtichste neidielen fan 'e earste generaasje PCR:

1.Prone foar net-spesifike amplifikaasje en falske positive resultaten.

2.De deteksje duorret in lange tiid en de operaasje is omslachtig.

3.Allinnich kwalitative test kin dien wurde

Twadde-generaasje Real-Time PCR

Real-Time PCR, ek bekend as qPCR, brûkt fluorescent probes dy't de fuortgong fan it reaksjesysteem oanjaan kinne, en kontrolearret de accumulation fan amplified produkten troch de accumulation fan fluorescent sinjalen, en beoardielet de resultaten fia de fluorescence curve.It kin wurde kwantifisearre mei help fan Cq wearde en standert kromme.

Om't de qPCR-technology wurdt útfierd yn in sletten systeem, wurdt de kâns op fersmoarging fermindere, en kin it fluoreszinsjesinjaal kontroleare wurde foar kwantitative deteksje, dus it is it meast brûkt yn klinyske praktyk en is de dominante technology yn PCR wurden.

De fluorescent stoffen brûkt yn real-time fluorescent kwantitative PCR kinne wurde ferdield yn: TaqMan fluorescent sonde, molekulêre beacons en fluorescent kleurstof.

1) TaqMan fluorescent sonde:

Tidens PCR-amplifikaasje wurdt in spesifike fluorescent probe tafoege by it tafoegjen fan in pear primer.De probe is in oligonucleotide, en beide úteinen binne markearre mei in reporter fluorescent groep en in quencher fluorescent groep.

As de sonde yntakt is, wurdt it fluorescent sinjaal útstjoerd troch de reportergroep opnomd troch de quenching-groep;tidens PCR amplification, de 5'-3' exonuclease aktiviteit fan Taq enzyme cleaves en degradearret de sonde, wêrtroch't de reporter fluorescerende groep en quencher De fluorescent groep wurdt skieden, sadat de fluorescence tafersjochsysteem kin ûntfange it fluorescence sinjaal, dat is, eltse kear in DNA-strân wurdt opboud fluorescent en fluorescent, fluorescent en fluorescent cence sinjaal is folslein syngronisearre mei de foarming fan de PCR produkt.

2) SYBR fluorescent kleurstof:

Yn it PCR-reaksjesysteem wurdt in oerskot fan SYBR-fluorescent kleurstof tafoege.Nei't de SYBR fluorescent kleurstof net-spesifyk is opnommen yn 'e DNA-dûbelstring, stjoert it in fluorescent sinjaal út.De SYBR-fervemolekule dy't net yn 'e keten opnommen is, sil gjin fluorescent sinjaal útstjoere, en soarget dêrmei foar it fluorescent sinjaal De ferheging fan PCR-produkten is folslein syngronisearre mei de ferheging fan PCR-produkten.SYBR bynt allinnich oan dûbel-stringed DNA, sadat de smeltkurve kin brûkt wurde om te bepalen oft de PCR-reaksje spesifyk is.

3) Molekulêre beaken:

It is in stam-lus dûbel-labele oligonucleotide probe dy't in haarspjeldstruktuer foarmet fan sawat 8 basen oan 'e 5 en 3 einen.De nukleïnesoere-sekwinsjes oan beide úteinen binne komplementêr keppele, wêrtroch't de fluorescent groep en de quenching-groep strak binne.Slút, gjin fluoreszinsje sil wurde produsearre.

Nei it generearjen fan it PCR-produkt, tidens it annealingproses, wurdt it middelste diel fan 'e molekulêre beaken keppele mei in spesifike DNA-sekwinsje, en it fluorescent gen wurdt skieden fan it quencher-gen om fluoreszinsje te produsearjen.

De wichtichste neidielen fan twadde generaasje PCR:

Gefoelichheid ûntbrekt noch, en de detectie fan eksimplaren mei leech kopy is net krekt.

D'r is de ynfloed fan 'e eftergrûnwearde, en it resultaat is gefoelich foar ynterferinsje.

As d'r PCR-ynhibitoren binne yn it reaksjesysteem, binne de deteksjeresultaten gefoelich foar ynterferinsje.

Tredde generaasje digitale PCR

Digitale PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) berekkent it kopynûmer fan 'e doelsekwinsje troch einpuntdeteksje, en kin krekte absolute kwantitative deteksje útfiere sûnder ynterne kontrôles en standertkurven te brûken.

Digitale PCR brûkt einpuntdeteksje en is net ôfhinklik fan 'e Ct-wearde (syklusdrompel), sadat de digitale PCR-reaksje minder beynfloede wurdt troch de amplifikaasje-effisjinsje, en de tolerânsje foar PCR-reaksje-ynhibitoren wurdt ferbettere, mei hege krektens en reprodusearberens.

Troch de skaaimerken fan hege gefoelichheid en hege krektens, wurdt it net maklik bemuoid troch PCR-reaksje-ynhibitoren, en kin it wiere absolute kwantifikaasje berikke sûnder standertprodukten, dy't in ûndersyks- en tapassing hotspot wurden is.

Neffens de ferskillende foarmen fan de reaksje ienheid, it kin wurde ferdield yn trije haadtypen: microfluidic, chip en droplet systemen.

1) Microfluidic digitale PCR, mdPCR:

Op grûn fan 'e mikrofluïdyske technology wurdt it DNA-sjabloan skieden.De microfluidic technology kin realisearje de stekproef nano-upgrading of de generaasje fan lytsere druppels, mar de druppels nedich in spesjale adsorption metoade en dan kombinearre mei de PCR reaksje systeem.mdPCR is stadichoan oannommen troch oare metoaden ferfange.

2) Droplet-basearre digitale PCR, ddPCR:

Brûk technology foar generaasje fan wetter-yn-oalje druppels om it stekproef te ferwurkjen yn druppels, en ferdiel it reaksjesysteem dat nukleïnesûrmolekulen befettet yn tûzenen nanoskaal druppels, elk fan dat befettet net it nukleïnesûrdoelmolekule dat moat wurde ûntdutsen, of Befettet ien oant ferskate nukleïnsûrdoelmolekulen dy't moatte wurde hifke.

3) Chip-basearre digitale PCR, cdPCR:

Brûk de yntegreare floeistofpaadtechnology om in protte mikrobuizen en mikrokaviteiten op silisiumwafels of kwartsglês te gravearjen, en kontrolearje de stream fan 'e oplossing troch ferskate kontrôlekleppen, en ferdiel de monsterflüssigens yn nanometers fan deselde grutte yn' e reaksjeputten foar digitale PCR-reaksje om absolute kwantifikaasje te berikken.

De wichtichste neidielen fan de tredde generaasje PCR:

De apparatuer en reagents binne djoer.

De sjabloan kwaliteit easken binne heech.As de sjabloan kwantiteit grutter is as de mikrosysteem kwantiteit, it sil ûnmooglik om te kwantifisearjen, en as it is te lyts, de kwantifisearring accuracy wurdt fermindere.

False positiven kinne ek generearre wurde as d'r net-spesifike amplifikaasje is.