COVID-19 is in ynfeksjesykte dy't feroarsake wurdt troch Sever Acute Respiratory Syndrome.

De samples dy't brûkt wurde foar testen kinne wurde sammele troch nasopharyngeale swabs of orofaryngeale swabs.

Wat is PCR?

De standertmetoade foar deteksje fan coronavirus is polymerase kettingreaksje, PCR.Dit is in metoade dy't in protte brûkt wurdt yn molekulêre biology.It kin gau miljoenen kopiearje nei miljarden spesifike DNA-fragminten.

It nije coronavirus befettet in heul lang single-stringed RNA-genoom.Om dizze firussen te ûntdekken troch PCR, moatte RNA-molekulen wurde omboud ta har komplementêre DNA-sekwinsjes troch reverse transkriptase, en dan kin it nij synthesisearre DNA wurde fersterke troch standert PCR-prosedueres, dy't ornaris bekend is as RT-PCR.

RT-PCR proses

RNA-ekstraksje

Om dizze metoade út te fieren, moat virale RNA yn prinsipe ekstrahearre wurde.In ferskaat oan RNA suvering kits kinne wurde brûkt foar handige, flugge en effektive skieding.

Om virale RNA te ekstrahearjen mei in kommersjele kit, foegje it monster earst ta oan in mikrosentrifugebuis en mingje it dan mei de lysisbuffer.Dizze buffer is tige denaturearre en bestiet meast út fenol en guanidine isothiocyanate.Derneist binne RNase-ynhibitoren normaal oanwêzich yn 'e lysisbuffer om isolaasje fan yntakt virale RNA te garandearjen.

Nei it tafoegjen fan de lysisbuffer, vortex de mingbuis mei puls en ynkubearje by keamertemperatuer.It firus wurdt dan lysearre ûnder tige denaturearjende omstannichheden levere troch de lysisbuffer.

Nei't it monster is lysed, wurdt in sintrifugebuis brûkt foar de suveringsproseduere.It stekproef wurdt laden yn 'e sintrifugebuis en dan sintrifugeare.

Dizze proseduere is in fêste faze ekstraksjemetoade wêryn de stasjonêre faze bestiet út in silikagelmatrix.

Under optimale sâlt- en pH-omstannichheden bine RNA-molekulen oan it silikamembraan.

Tagelyk wurde proteïne en oare kontaminanten fuortsmiten.

Nei sintrifugering set de sintrifugebuis yn in skjinne sammelbuis, smyt it filtraat ôf en foegje dan waskbuffer ta.

Plak de buis wer yn 'e sintrifuge om de waskbuffer troch it membraan te twingen.Dit sil alle oerbleaune ûnreinheden fan 'e membraan fuortsmite, wêrtroch allinich it RNA oan' e silikagel is bûn.

Nei't it monster is wosken, set de buis yn in skjinne mikrosentrifuge-buis en foegje de elutiebuffer ta.

It wurdt dan sintrifugeare om de elueringsbuffer troch it membraan te twingen.De elueringsbuffer ferwideret virale RNA út 'e spinkolom en krijt suvere RNA frij fan aaiwiten, ynhibitoren en oare kontaminanten.

STAP 2

Mixed konsintraasje

Nei it ekstrahearjen fan it virale RNA, is de folgjende stap om it reaksjegemik te meitsjen foar PCR-amplifikaasje.Yn dizze stap wurdt konsintraasje brûkt.Dizze konsintrearre oplossing is in premixed konsintrearre oplossing besteande út in premix, reverse transcriptase, nucleotides, foarút primer, reverse primer, TaqMan probe en DNA polymerase.

As lêste, om dit reaksjegemik te foltôgjen, wurdt it RNA-sjabloan tafoege.De buizen wurde mingd troch pulsvortexing, en dan wurdt it reaksjegemik yn 'e PCR-plaat laden.De PCR-plaat befettet normaal 96 putten en kin meardere samples tagelyk analysearje.

STAP 3

PCR amplification

Pleats dan de plaat yn 'e PCR-masine, dy't yn essinsje in termyske fytser is.

Real-time RT-PCR wurdt brûkt om it nije coronavirus fan 2019 te detektearjen troch de doelsekwinsje te fersterkjen yn it RdrRP-gen, E-gen en N-gen.De kar fan doelgen is ôfhinklik fan 'e primer en probe-sekwinsje.

De earste stap fan RT-PCR is omkearde transkripsje.De earste strân fan komplementêr DNA wurdt synthesized, dat wurdt inisjeare troch de PCR reverse primer, dy't bynt oan it komplementêre diel fan it firale RNA genoom.Dan foeget reverse transkriptase DNA-nukleotiden ta oan it 3'-ein fan 'e primer om DNA komplemintêr te synthesearjen oan it virale RNA.De temperatuer en doer fan dizze stap binne ôfhinklik fan de brûkte primers, doel-RNA, en reverse transkriptase.

Dêrnei wurdt in earste denaturaasjestap tapast, wat resulteart yn de denaturaasje fan 'e RNA-DNA-hybride.Dizze stap is nedich om de DNA-polymerase te aktivearjen.Tagelyk wurdt reverse transkriptase ynaktivearre.

PCR bestiet út in searje termyske syklusen.Elke syklus bestiet út denaturaasje, annealing en útwreidingsstappen.

De denaturaasjestap omfettet it ferwaarmjen fan de reaksjekeamer oant 95 graden Celsius en it brûken fan it foar denaturaasje fan it dûbelstrengige DNA-sjabloan.

Yn 'e folgjende stap wurdt de reaksjetemperatuer fermindere nei 58 graden Celsius, wêrtroch't de foarút primer kin annealje oan it komplementêre diel fan har single-strâne DNA-sjabloan.De annealing temperatuer direkt hinget ôf fan 'e lingte en gearstalling fan' e primer.

Yn 'e útwreidingsstap syntetisearret de DNA-polymerase in nije DNA-streng dy't komplemintêr is foar de DNA-sjabloanstreng.Troch it tafoegjen fan frije kearnen komplemintêr oan it sjabloan yn 'e 5'oant 3'rjochting fan it reaksjegemik.De temperatuer fan dizze stap hinget ôf fan 'e brûkte DNA-polymerase.

Nei de earste syklus wurdt in dûbelstrenged DNA-doel krigen.

Fier dan de twadde syklus yn.It dûbelstrengige DNA wurdt denaturearre om twa ienstrengige DNA-molekulen te meitsjen.

Yn 'e folgjende stap wurdt de reaksjetemperatuer ferlege, de primers wurde annealed oan elke single-stranded DNA-sjabloan, en de Taq-man-probe wurdt annealed oan it komplementêre diel fan it doel-DNA.

De TaqMan-probe bestiet út in fluorofoor kovalent keppele oan it 5'-ein fan 'e oligonukleotideprobe.As opwekke troch de ljochtboarne fan 'e fytser, stjoert de fluorofoor fluoreszinsje út.Derneist is de sonde gearstald út in quencher oan 'e 3'-ein.De buert fan it reportergen by de quencher foarkomt de deteksje fan fluoreszinsje.

Yn 'e útwreidingsstap syntetisearret de DNA-polymerase in nije strân.As de polymerase de TaqMan-probe berikt, knipt syn endogene 5'nuclease-aktiviteit de sonde, en skiedt de kleurstof fan 'e quencher.

Mei elke syklus fan PCR wurde mear kleurstofmolekulen frijlitten, wat resulteart yn in ferheging fan fluorescensintensiteit evenredich mei it oantal synthesisearre amplicons.

Dizze metoade lit it oantal skatten fan in opjûne folchoarder oanwêzich yn 'e stekproef.It oantal dûbelstrengige DNA-fragminten ferdûbelet yn elke syklus.Dêrom kin PCR brûkt wurde om heul lytse samples te analysearjen.

Foar it mjitten fan fluorescent sinjaal, wolfraam halogeen lamp, excitation filter, reflector, lens, emisje filter en lading keppele apparaat-gebrûk CCD kamera.

STAP 4 Detect

Foar it mjitten fan fluorescent sinjaal, wolfraam halogeen lamp, excitation filter, reflector, lens, emisje filter en lading keppele apparaat-gebrûk CCD kamera.

It filtere ljocht fan 'e lampe wurdt reflektearre troch de reflektor, giet troch de kondensorlens en is rjochte op it sintrum fan elk gat.Dan de fluorescence útstjoerd út it gat wurdt wjerspegele út de spegel, giet troch it emisje filter, en wurdt ûntdutsen troch de CCD kamera.Yn elke PCR-syklus kin it sels-opteinste fluorofoorljocht troch de CCD ûntdutsen wurde.

It konvertearret it fêstlein ljocht yn digitale gegevens.Dizze metoade wurdt real-time PCR neamd, en it makket it mooglik om realtime tafersjoch te meitsjen fan 'e fuortgong fan' e PCR-reaksje.