Eltsenien praat oer it prinsipe fan qRT-PCR eksperimint, primer design, resultaat ynterpretaasje, ensfh, mar ik tink dat ik moat diele mei jo de eksperimintele wurking fan qRT-PCR.It is lyts, mar it giet oer resultaten.
Foardat jo qRT-PCR dogge, moatte wy in dúdlik begryp hawwe fan ús eigen RNA en operaasjemetoaden.Us ynspanningen binne ommers rjochte op it krijen fan resultaten, ynstee fan gewoan te oefenjen.Dus foardat jo qRT-PCR dogge, moatte wy de folgjende problemen bepale (guon dêrfan binne allinich fan tapassing op SYBR).
1 Binne jo wis dat jo RNA net degradearre is?
NanoDrop 2000 kin allinnich detect de konsintraasje en suverens fan RNA, mar kin net detect de yntegriteit fan RNA.
De RNA-wearde (RNA-intesiteitnûmer) kin de yntegriteit fan it RNA reflektearje, dat wurdt ûntdutsen troch it Agilent 2100 Bioanalyzer-systeem.
Fig. Skematyske diagram fan RIN-wearden foar ferskate RNA-samples (eukaryoten)
Laboratoria hawwe lykwols oer it algemien gjin Agilent 2100 Bioanalyzer.Yn dit gefal, kinne wy detect troch formaldehyde gel, mar de eask foar it totale bedrach fan RNA is heech, dus de fluchste metoade is it brûken fan gewoane gel electrophoresis.It is ferplichte om yn in nukleasefrije omjouwing te wêzen, dus it is nedich om de elektroforesetank, solfles, gelbeugel en kam te spoelen mei DEPC-wetter.De agarose is ek nuclease-frij (sa lang as it is fris iepene), en de Loading Buffer moat wurde fris iepene safolle mooglik, mei 1,2% gel.
Tink derom dat de gel folslein oplost wurde moat, oars sil it inhomogene bands feroarsaakje, lykas werjûn yn sample 9 yn 'e figuer.As de spanning is te heech of rint foar te lang sil generearje waarmte en feroarsaakje RNA degradaasje, dus de spanning en tiid moatte wurde regele ridlik.Dêrneist gel running kin ek fierder bepale oft der DNA-resten yn de stekproef, en observearje oft der in grut oantal bewarre bands yn de dispensing goed.
Stal.Gelelektroforese-deteksje fan RNA
2 Binne jo wis oer de konsintraasje fan jo cDNA?
De ûnderfining fan 'e grutte bruorren yn it laboratoarium is dat it cDNA fan it 20 ul-systeem dat wurdt krigen troch elke omkearing direkt 20X verdund wurdt, wylst de postdoktorale susters 10X wurde verdund.Ik bin meastentiids ôfhinklik fan 'e situaasje.Om't de kwaliteit fan it RNA neamd troch elke persoan oars is, is it nivo fan omkearing ek oars, en kin de omkeartechnology net stabyl wêze.
Dus elke kear as ik it omkearde cDNA krij, sil ik it earst sa'n 3 kear ferwiderje, en dan it húshâldingsgen brûke om RT-PCR te dwaan, it oantal syklusen is oer it generaal 25 syklusen, om de spesifike konsintraasje te identifisearjen, en dan de definitive verdunningsfaktor te bepalen.
3 Binne jo wis dat jo primers maklik te brûken binne?
It kin trochjaan de melting kromme fan qRT-PCR, mar dit noch kostet jild.Foar laboratoaria sûnder in soad jild, as se in protte primers krije, kinne se gewoane RT-PCR brûke om te sjen oft it in inkele band is en de spesifisiteit fan 'e primers identifisearje.As it laboratoarium gjin jild hat, kin de spesifisiteit fan alle primers ien kear identifisearre wurde troch de smeltkurve.
4 Binne jo wis dat jo eksperimintele betingsten geskikt binne?
SYBR moat wurde beskerme út sterk ljocht, dus besykje te skeakeljen de overhead ljocht doe't it tafoegjen fan SYBR reagens, en allinne moatte brûke dimmen ljocht te foltôgjen it.
Bewarje SYBR op 4 °C.As jo yn gebrûk binne, omkeare foarsichtich op en del om goed te mingjen om skomjen te foarkommen, en draai net krêftich.
Guon jongere susters wolle graach tekens tekenje op it PCR-boerd út eangst om de samples te mingjen, wat ferkeard is.Om't jo markers heul wierskynlik de kolleksje fan fluorescent sinjalen sille beynfloedzje, advisearje ik junioaren oer it algemien om eksperimintele notebooks te brûken om te helpen yn it ûnthâld, lykas hjirûnder werjûn.
Stal.qRT-PCR sample laden diagram
5 Binne jo wis dat jo dogge it goed?
Wês wis te dragen wanten, wear wanten, wear wanten, en sis wichtige dingen trije kear.
Om de bleatstelling fan SYBR oan ljocht te ferminderjen, foegje ik persoanlik graach earst in sjabloan ta, lykas werjûn yn 'e ôfbylding hjirûnder.Neffens ûnderfining, de tafoeging fan in lyts bedrach fan sjabloan is wierskynlik sampling flaters.Dêrom, om te minimalisearjen de flater feroarsake troch it tafoegjen fan in lyts bedrach fan sjabloan, Ik ferdûbelje meastentiids de stekproef wer, en ferdûbelje it bedrach as it tafoegjen fan de stekproef te ferminderjen it bedrach fan H2O2 tafoege.
Stal.Skematyske diagram fan qRT-PCR-laden
Konfigurearje dan it qRT-PCR-systeem as folget.
Stal.qRT-PCR systeem tarieding diagram
OPMERKING: It konfiguraasjeproses moat op iis dien wurde.
Nei it tafoegjen fan it monster, plak de transparante sealingfilm.Besykje it oerflak fan 'e transparante sealingfilm net mei jo hannen te berikken, operearje gewoan fanút de romte oan beide kanten fan' e film.Om't fingerprinten ek ynfloed kinne op de kolleksje fan fluorescent sinjalen.Brûk dan in sintrifuge om fluch 10 s op lege snelheid te centrifugeren om foar te kommen dat it stekproef oan 'e muorre hinget.
Relatearre produkten:
Post tiid: Apr-28-2023
