As in nij yn it laboratoarium, it is gjin goede baan in skerm út positive planten út in bosk planten mei in lege konverzje rate.As earste moat DNA ien foar ien út in grut oantal samples ekstrahearre wurde, en dan wurde de frjemde genen ûntdutsen troch PCR.Lykwols, de resultaten binne faak blanks en bands mei in pear items soms, mar it is ûnmooglik om te bepalen oft der miste detections of falske detections..Is it heul helpleas om sa'n eksperiminteel proses en resultaten te konfrontearjen?Sit gjin soargen, broer leart jo hoe't jo transgene positive planten maklik en sekuer kinne skermje.

Stap 1

Design detection primers

Bepale it endogene gen en it eksogene gen dat moat wurde ûntdutsen neffens it te testen stekproef, en selektearje in represintative 100-500bp-sekwinsje yn it gen foar primerûntwerp.Goede primers kinne de krektens fan 'e deteksjeresultaten garandearje en de deteksjetiid ferkoartje (sjoch de taheakke foar gewoan brûkte deteksjeprimers).

Opmerking: De nij ûntworpen primers moatte de reaksjebetingsten optimalisearje en de krektens, krektens en deteksjelimyt fan 'e detectie ferifiearje foardat op grutskalige deteksje is.

Stap 2

Untwerp eksperiminteel protokol

Posityf kontrôle: Brûk it suvere DNA dat it doelfragmint befettet as sjabloan om te bepalen oft it PCR-reaksjesysteem en betingsten normaal binne.

Negatyf / lege kontrôle: Brûk it DNA-sjabloan of ddH2O dat it doelfragmint net as sjabloan befettet om te detektearjen oft der in boarne fan fersmoarging is yn it PCR-systeem.

Ynterne referinsjekontrôle: brûk de primer / probe-kombinaasje fan it endogene gen fan it te testen stekproef om te evaluearjen oft it sjabloan kin wurde ûntdutsen troch PCR.

Notysje:

Positive, negative / lege kontrôles en ynterne kontrôlekontrôles moatte wurde ynsteld foar elke test om de jildigens fan 'e eksperimintele resultaten te evaluearjen.

Eksperimint tarieding

Foardat gebrûk, observearje oft de oplossing is evenredich mingd.As delslach fûn wurdt, moat it foar gebrûk oplost en mingd wurde neffens de ynstruksjes.2 × PCR-mix moat wurde pipetteare en meardere kearen mingd mei in mikropipette foar gebrûk om unjildich ionferdieling te foarkommen.

Notysje:

Nim de hantlieding út en lês it soarchfâldich, en meitsje tariedings foar it eksperimint yn strikt oerienstimming mei de easken fan 'e hantlieding.

Stap 4

Prepare PCR reaksje systeem

Neffens it eksperimintele protokol, mix de primers, H2O, en 2 × PCR mingd evenredich, sintrifugerje en fersprieden se nei elke reaksjebuis.

Notysje:

Foar grutskalige as lange termyn testen wurdt it oanrikkemandearre om in PCR-reaksjesysteem te brûken dat UNG-enzyme befettet, dat effektyf aerosolkontaminaasje kin foarkomme feroarsake troch PCR-produkten.

Stap 5

Add reaksje sjabloan

Mei help fan Direct PCR technology, der is gjin ferlet fan ferfeelsum nucleic acid suvering proses, de stekproef sjabloan kin wurde taret binnen 10 minuten, en it oerienkommende PCR reaksje systeem kin wurde tafoege.

Notysje:

De spaltingmetoade hat better deteksjeeffekt, en it verkregen produkt kin brûkt wurde foar meardere deteksjereaksjes.

5.1: Direkte útwreiding fan blêden

Neffens de grutte fan 'e foto yn' e hantlieding, snij it blêdweefsel mei in diameter fan 2-3mm en pleats it yn it PCR-reaksjesysteem.

Opmerking: Soargje derfoar dat de blêdfragminten folslein ûnderdompele binne yn 'e PCR-reaksje-oplossing, en foegje gjin oermjittich blêdweefsel ta.

5.2: Leaf split metoade

Snij it blêdweefsel mei in diameter fan 5-7mm en pleats it yn in sintrifugebuis.As jo ​​kieze foar folwoeksen blêden, foarkomme asjebleaft it brûken fan 'e weefsels fan' e haadader fan it blêd.Pipette 50ul Buffer P1 lysate yn in centrifuge buis om te soargjen dat de lysate kin hielendal ûnderdompelje it blêd weefsel, pleats it yn in termyske cycler of in metalen bad, en lyse op 95 ° C foar 5-10 minuten.

Foegje 50 ul buffer P2 neutralisaasjeoplossing ta en mingje goed.It resultearjende lysate kin brûkt wurde as sjabloan en tafoege oan it PCR-reaksjesysteem.

Opmerking: It bedrach fan sjabloan is tusken 5-10% fan it PCR-systeem, en moat net mear as 20% wêze (bygelyks yn in 20μl PCR-systeem, add 1-2μl lysis-oplossing, net mear as 4μl).

Stap 6

PCR reaksje

Nei it sintrifugearjen fan de PCR-reaksjebuis wurdt it yn in PCR-ynstrumint pleatst foar amplifikaasje.

Notysje:

De reaksje brûkt net-suvere sjabloan foar amplifikaasje, sadat it oantal amplifikaasje-syklusen 5-10 mear syklusen is as by it brûken fan suvere DNA-sjabloan.

Stap 7

Elektroforese-deteksje en resultaatanalyse

M: 100bp DNA Ladder

1\4: Purified DNA metoade

2\5: Direkte PCR-metoade

3\6: Lege kontrôle

QC:

De testresultaten fan 'e ferskate kontrôles ynsteld yn it eksperimint moatte oan' e folgjende betingsten foldwaan.Oars, de oarsaak fan it probleem moat wurde analysearre, en de test moat wurde útfierd wer neidat it probleem is eliminearre.

Tabel 1. Normale testresultaten fan ferskate kontrôlegroepen

* As it plasmide wurdt brûkt as in positive kontrôle, kin it endogene gen-testresultaat negatyf wêze

Resultaat oardiel:

A. It testresultaat fan it endogene gen fan 'e stekproef is negatyf, wat oanjout dat it DNA dat geskikt is foar gewoane PCR-deteksje kin net út 'e stekproef helle wurde of it ekstrahearre DNA befettet PCR-reaksje-ynhibitoren, en it DNA moat opnij ekstrahearre wurde.

B. It testresultaat fan it endogene gen fan 'e stekproef is posityf, en it testresultaat fan' e eksogene gen is negatyf, wat oanjout dat DNA geskikt is foar gewoane PCR-deteksje út 'e stekproef ekstrakt wurdt, en it kin wurde beoardiele dat it XXX-gen net yn 'e stekproef ûntdutsen wurdt.

C. It testresultaat fan it endogene gen fan 'e stekproef is posityf, en it testresultaat fan' e eksogene gen is posityf, wat oanjout dat DNA geskikt is foar gewoane PCR-deteksje is út 'e stekproef ekstrakt, en it sample DNA befettet it XXX-gen.Befêstigingseksperiminten kinne fierder wurde útfierd.

Stap 8

Design detection primers

Nei it eksperimint brûke 2% natriumhypochlorite-oplossing en 70% ethanol-oplossing om it eksperiminteel gebiet te wiskjen om miljeufersmoarging te foarkommen.