Oersicht
Snelle identifikaasje fan transgene planten
Tekst/Tong Yucheng
Eksperimintele operaasje / Han Ying
Redakteur / Wen Youjun
Wurden/1600+
Oanbefelle lêstiid / 8-10 minuten
Snelle identifikaasje fan transgene planten
As nijkommer yn it laboratoarium is it gjin goede baan om positive planten út in boskje planten mei in lege konverzje te skermjen.As earste moat DNA ien foar ien út in grut oantal samples ekstrahearre wurde, en dan wurde de frjemde genen ûntdutsen troch PCR.Lykwols, de resultaten binne faak blanks en bands mei in pear items soms, mar it is ûnmooglik om te bepalen oft der miste detections of falske detections..Is it heul helpleas om sa'n eksperiminteel proses en resultaten te konfrontearjen?Sit gjin soargen, broer leart jo hoe't jo transgene positive planten maklik en sekuer kinne skermje.
Stap 1: Design detection primers
Bepale it endogene gen en it eksogene gen dat moat wurde ûntdutsen neffens it te testen stekproef, en selektearje in represintative 100-500bp-sekwinsje yn it gen foar primerûntwerp.Goede primers kinne de krektens fan 'e deteksjeresultaten garandearje en de deteksjetiid ferkoartje (sjoch de taheakke foar gewoan brûkte deteksjeprimers).
Noat:
De nij ûntworpen primers moatte de reaksjebetingsten optimalisearje en de krektens, krektens en deteksjelimyt fan 'e deteksje ferifiearje foardat se grutskalige deteksje útfiere.
Stap 2:Untwikkelje eksperiminteel protokol
Posityf kontrôle: Brûk it suvere DNA dat it doelfragmint befettet as sjabloan om te bepalen oft it PCR-reaksjesysteem en betingsten normaal binne.
Negatyf / lege kontrôle: Brûk in DNA-sjabloan of ddH2O dat net befetsje it doel fragmint as sjabloan foar in detect oft der in boarne fan fersmoarging yn de PCR systeem.
Ynterne referinsjekontrôle: brûk de primer / probe-kombinaasje fan it endogene gen fan it te testen stekproef om te evaluearjen oft it sjabloan kin wurde ûntdutsen troch PCR.
Noat:
Positive, negative / lege kontrôles en ynterne kontrôlekontrôles moatte wurde ynsteld foar elke test om de jildigens fan 'e eksperimintele resultaten te evaluearjen.
Stap 3: Eksperimint tarieding
Foardat gebrûk, observearje oft de oplossing is evenredich mingd.As delslach fûn wurdt, moat it foar gebrûk oplost en mingd wurde neffens de ynstruksjes.2 × PCR-mix moat wurde pipetteare en meardere kearen mingd mei in mikropipette foar gebrûk om unjildich ionferdieling te foarkommen.
Noat:
Nim de ynstruksjes út en lês se soarchfâldich, en meitsje tariedings foar it eksperimint yn strikt oerienstimming mei de ynstruksjes.
Stap 4: Prepare PCR-reaksjesysteem
Neffens it eksperimintele protokol mingje de primers, H2O, 2 × PCR-mix, sintrifuge en fersprieden se nei elke reaksjebuis.
Noat:
Foar grutskalige as lange termyn testen wurdt it oanrikkemandearre om in PCR-reaksjesysteem te brûken dat UNG-enzyme befettet, dat effektyf aerosolkontaminaasje kin foarkomme feroarsake troch PCR-produkten.
Stap 5: Foegje reaksjesjabloan ta
Mei it brûken fan Direct PCR-technology is d'r gjin ferlet fan ferfeelsum nukleïnesûrreinigingsproses.De sample sjabloan kin wurde taret binnen 10 minuten en tafoege oan de oerienkommende PCR reaksje systeem.
Noat:
De Lysis-metoade hat in better deteksjeeffekt, en it verkregen produkt kin brûkt wurde foar meardere deteksjereaksjes.
5.1: Direkte PCR fan blêden
Neffens de grutte fan 'e foto yn' e hantlieding, snij it blêdweefsel mei in diameter fan 2-3mm en pleats it yn it PCR-reaksjesysteem.
Opmerking: Soargje derfoar dat de blêdfragminten folslein ûnderdompele binne yn 'e PCR-reaksje-oplossing, en foegje gjin oermjittich blêdweefsel ta.
5.2: Leaf lysis metoade
Snij it blêdweefsel mei in diameter fan 5-7mm en pleats it yn in sintrifugebuis.As jo kieze foar folwoeksen blêden, foarkomme asjebleaft it brûken fan 'e weefsels fan' e haadader fan it blêd.Pipette 50ul Buffer P1 lysate yn in centrifuge buis om te soargjen dat de lysate kin hielendal ûnderdompelje it blêd weefsel, pleats it yn in termyske cycler of in metalen bad, en lyse op 95 ° C foar 5-10 minuten.
Foegje 50 ul buffer P2 neutralisaasjeoplossing ta en mingje goed.It resultearjende lysate kin brûkt wurde as sjabloan en tafoege oan it PCR-reaksjesysteem.
Opmerking: It bedrach fan sjabloan moat wêze tusken 5-10% fan de PCR systeem, en moat net mear as 20% (Bygelyks, yn in 20μl PCR systeem, add 1-2μl lysis buffer, net mear as 4μl).
Stap 6: PCR-reaksje
Nei it sintrifugearjen fan de PCR-reaksjebuis, pleatse se yn in PCR-ynstrumint foar amplifikaasje.
Noat:
De reaksje brûkt net-suvere sjabloan foar amplifikaasje, sadat it oantal amplifikaasje-syklusen 5-10 mear syklusen is as by it brûken fan suvere DNA-sjabloan.
Stap 7: Elektroforese-deteksje en resultaatanalyse
M:100bp DNA Ladder
1\4: Purified DNA metoade
2\5: Direkte PCR-metoade
3\6: Lege kontrôle
Kwaliteitsbeweitsing:
De testresultaten fan 'e ferskate kontrôles ynsteld yn it eksperimint moatte oan' e folgjende betingsten foldwaan.Oars, de oarsaak fan it probleem moat wurde analysearre, en de test moat wurde útfierd wer neidat it probleem is eliminearre.
Tabel 1. Normale testresultaten fan ferskate kontrôlegroepen
* As it plasmide wurdt brûkt as in positive kontrôle, kin it endogene gen-testresultaat negatyf wêze
Resultaat oardiel:
A. It testresultaat fan it endogene gen fan 'e stekproef is negatyf, wat oanjout dat it DNA dat geskikt is foar gewoane PCR-deteksje kin net út 'e stekproef helle wurde of it ekstrahearre DNA befettet PCR-reaksje-ynhibitoren, en it DNA moat opnij ekstrahearre wurde.
B. It testresultaat fan it endogene gen fan 'e stekproef is posityf, en it testresultaat fan' e eksogene gen is negatyf, wat oanjout dat it DNA dat geskikt is foar gewoane PCR-deteksje wurdt út 'e stekproef ekstrakt, en it kin wurde beoardiele dat it XXX-gen net yn 'e stekproef ûntdutsen is.
C. It testresultaat fan it endogene gen fan 'e stekproef is posityf, en it testresultaat fan' e eksogene gen is posityf, wat oanjout dat it DNA dat geskikt is foar gewoane PCR-deteksje is út 'e stekproef ekstrakt, en it sample DNA befettet it XXX-gen.Befêstigingseksperiminten kinne fierder wurde útfierd.
Stap 8: Untwerp detection primers
Nei it eksperimint brûke 2% natriumhypochlorite-oplossing en 70% ethanol-oplossing om it eksperiminteel gebiet te wiskjen om miljeufersmoarging te foarkommen.
Taheakke
Tabel 2. Faak brûkte primers foar algemiene PCR-deteksje fan genetysk modifisearre planten
Referinsjedokumint:
SN/T 1202-2010, Kwalitative PCR-deteksjemetoade foar genetysk modifisearre plantyngrediïnten yn iten.
Ministearje fan Lânbou Oankundiging 1485-5-2010, Testen fan 'e yngrediïnten fan genetysk modifisearre planten en har produkten - rys M12 en syn derivaten.
Posttiid: Jun-09-2021
