1. Basiskennis (as jo it eksperimintele diel sjen wolle, oermeitsje dan direkt nei it twadde diel)
As in derivative reaksje fan konvinsjonele PCR, Real time PCR kontrolearret benammen de feroaring fan it bedrach fan amplification produkt yn elke syklus fan de PCR amplification reaksje yn it echte tiid troch de feroaring fan de fluorescence sinjaal, en kwantitatyf analyzes it begjinpunt sjabloan troch de relaasje tusken de ct wearde en de standert kromme.
De spesifike gegevens fan RT-PCR binnebasisline, fluorescence drompelenCt wearde.
| basisline: | De fluoreszinsjewearde fan 'e 3e-15e syklus is de basisline (basisline), dy't feroarsake wurdt troch de ynsidintele flater fan' e mjitting. |
| Drompel (drompel): | Ferwiist nei de limyt foar fluoreszensjedeteksje ynsteld op in passende posysje yn 'e eksponinsjele groeiregio fan' e amplifikaasjekromme, yn 't algemien 10 kear de standertdeviaasje fan' e basisline. |
| CT wearde: | It is it oantal PCR-syklusen as de fluoreszinsjewearde yn elke reaksjebuis de drompel berikt. De Ct wearde is omkeard evenredich mei it bedrach fan initial sjabloan. |
Algemiene etiketteringmetoaden foar RT-PCR:
| metoade | foardiel | tekoart | tapassingsgebiet |
| SYBR GreenⅠ | Wide tapasberens, gefoelich, goedkeap en handich | Primer easken binne heech, gefoelich foar net-spesifike bands | It is geskikt foar kwantitative analyze fan ferskate doelgenen, ûndersyk nei genekspresje, en ûndersyk nei transgene rekombinante bisten en planten. |
| TaqMan | Goede spesifisiteit en hege repeatability | De priis is heech en allinich geskikt foar spesifike doelen. | Pathogendeteksje, genûndersyk foar drugsresistinsje, beoardieling fan drugseffektiviteit, diagnoaze fan genetyske sykten. |
| molekulêre beaken | Hege spesifisiteit, fluoreszinsje, lege eftergrûn | De priis is heech, it is allinich geskikt foar in spesifyk doel, it ûntwerp is dreech, en de priis is heech. | Spesifike gene analyze, SNP analyze |
2. Eksperimintele stappen
2.1 Oer de eksperimintele groepearring- d'r moatte meardere putten yn 'e groep wêze, en d'r moatte biologyske werhellingen wêze.
| ① | Lege kontrôle | Wurdt brûkt om de selgroeistatus te detektearjen yn eksperiminten |
| ② | Negatyf kontrôle siRNA (net-spesifike siRNA-sekwinsje) | Demonstrearje de spesifisiteit fan RNAi-aksje.siRNA kin net-spesifike stress-antwurd opwekke by in konsintraasje fan 200nM. |
| ③ | Transfeksje Reagent Control | Útslute de toxicity fan it transfeksje reagens oan 'e sellen as it effekt op' e ekspresje fan it doelgen |
| ④ | siRNA tsjin doelgen | Sla de ekspresje fan it doelgen del |
| ⑤ (opsjoneel) | posityf siRNA | Wurdt brûkt om problemen mei eksperimintele systeem en operasjonele problemen op te lossen |
| ⑥ (opsjoneel) | Fluorescent kontrôle siRNA | De effisjinsje fan seltransfeksje kin wurde waarnommen mei in mikroskoop |
2.2 Prinsipes fan primer design
| Amplified fragmint grutte | It leafst op 100-150bp |
| Primer Lengte | 18-25 bp |
| GC ynhâld | 30% -70%, leafst 45% -55% |
| Tm wearde | 58-60 ℃ |
| Folchoarder | Avoid T / C kontinu;A / G trochgeande |
| 3 ein folchoarder | Avoid GC ryk of AT ryk;de terminalbasis is by foarkar G of C;it is it bêste om T te foarkommen |
| Komplementariteit | Meitsje komplementêre sekwinsjes fan mear as 3 basen binnen de primer of tusken twa primers |
| Spesifisiteit | Brûk blast-sykjen om primerspesifisiteit te befêstigjen |
①SiRNA is soarte-spesifyk, en de sekwinsjes fan ferskate soarten sille oars wêze.
②SiRNA wurdt ferpakt yn gevriesdroogde poeder, dat kin wurde opslein stabyl foar 2-4 wiken by keamertemperatuer.
2.3 Tools of reagents dy't moatte wurde taret foarôf
| Primer (ynterne referinsje) | Ynklusyf foarút en reverse twa |
| Primers (doelgen) | Ynklusyf foarút en reverse twa |
| Target Si RNA (3 strips) | Algemien sil it bedriuw 3 strips syntetisearje, en dan ien fan 'e trije kieze troch RT-PCR |
| Transfeksje Kit | Lipo2000 ensfh. |
| RNA Rapid Extraction Kit | Foar RNA-ekstraksje nei transfeksje |
| Rapid Reverse Transcription Kit | foar cDNA-synteze |
| PCR Amplification Kit | 2× Super SYBR Grien qPCR Master Mix |
2.4 Oangeande de saken dêr't omtinken foar jûn wurde moat yn de spesifike eksperimintele stappen:
①siRNA transfeksjeproses
1. Foar plating kinne jo kieze 24-well plaat, 12-well plaat of 6-well plaat (de gemiddelde RNA konsintraasje foarsteld yn elke boarne fan in 24-well plaat is oer 100-300 ng / uL), en de optimale transfection tichtens fan sellen is oant 60% -80% of sa
2. De transfeksjestappen en spesifike easken binne strikt yn oerienstimming mei de ynstruksjes.
3. Nei transfeksje kinne samples binnen 24-72 oeren sammele wurde foar mRNA-deteksje (RT-PCR) of proteïne-deteksje binnen 48-96 oeren (WB)
② RNA-ekstraksjeproses
1. Foarkom kontaminaasje troch eksogene enzymen.It omfettet benammen it dragen fan maskers en wanten strikt;mei help fan sterilisearre pipet tips en EP buizen;it wetter dat brûkt wurdt yn it eksperimint moat RNase-frij wêze.
2. It is oan te rieden om twa kear te dwaan as suggerearre yn 'e snelle ekstraksje kit, dy't de suverens en opbringst echt ferbetterje sil.
3. De ôffalflüssigens moat de RNA-kolom net oanreitsje.
③ RNA kwantifikaasje
Nei't it RNA ekstrahearre is, kin it direkt mei Nanodrop kwantifisearre wurde, en de minimale lêzing kin sa leech wêze as 10ng / ul.
④Reverse transkripsjeproses
1. Troch de hege gefoelichheid fan RT-qPCR moatte op syn minst 3 parallelle boarnen makke wurde foar elke stekproef om te foarkommen dat de folgjende Ct te oars is of de SD te grut is foar statistyske analyze.
2. Net befrieze en thaw Master mix werhelle.
3. Elke buis / gat moat wurde ferfongen troch in nije tip!Brûk deselde pipetpunt net kontinu om samples ta te foegjen!
4. De film dy't oan 'e 96-well plaat hechte is nei it tafoegjen fan it probleem moat mei in plaat glêd wurde.It is it bêste om te sintrifuge foardat jo it op 'e masine sette, sadat de floeistof op' e buismuorre nei ûnderen kin streame en luchtbellen ferwiderje.
⑤ Mienskiplike krommeanalyse
| Gjin perioade fan logaritmyske groei | Mooglik hege konsintraasje fan template |
| Gjin CT wearde | Ferkearde stappen foar it opspoaren fan fluorescent sinjalen; degradaasje fan primers of probes - syn yntegriteit kin ûntdutsen wurde troch PAGE elektroforese; net genôch bedrach fan sjabloan; ôfbraak fan sjabloanen - it foarkommen fan de ynfiering fan ûnreinheden en werhelle freezing en thawing yn sample tarieding; |
| Ct>38 | Low amplification effisjinsje;PCR produkt is te lang;ferskate reaksje komponinten wurde degradearre |
| Lineêre amplifikaasjekromme | Probes kinne foar in part degradearre wurde troch werhelle freeze-taai-syklusen of langere bleatstelling oan ljocht |
| It ferskil yn dûbele gatten is benammen grut | De reaksje oplossing is net hielendal smolten of de reaksje oplossing wurdt net mingd;it termyske bad fan it PCR-ynstrumint is fersmoarge troch fluorescent stoffen |
2.5 Oer gegevens analyze
De gegevensanalyse fan qPCR kin wurde ferdield yn relative kwantifikaasje en absolute kwantifikaasje.Bygelyks sellen yn 'e behannelingsgroep fergelike mei sellen yn' e kontrôtgroep,
Hoefolle kearen feroaret it mRNA fan it X-gen, dit is relative kwantifikaasje;yn in bepaald oantal sellen, it mRNA fan it X-gen
Hoefolle eksimplaren binne der, dit is absolute kwantifikaasje.Meastentiids is wat wy it meast brûke yn it laboratoarium de relative kwantitative metoade.Gewoanwei,de 2-ΔΔct metoadewurdt it meast brûkt yn eksperiminten, dus allinich dizze metoade sil hjir yn detail yntrodusearre wurde.
2-ΔΔct-metoade: It resultaat krigen is it ferskil yn 'e ekspresje fan it doelgen yn' e eksperimintele groep relatyf oan it doelgen yn 'e kontrôtgroep.It is fereaske dat de amplifikaasje-effisjinsjes fan sawol it doelgen as it ynterne referinsjegen tichtby 100% binne, en de relative ôfwiking moat net mear wêze as 5%.
De berekkeningsmetoade is as folget:
Δct-kontrôlegroep = ct-wearde fan doelgen yn kontrôlegroep - ct-wearde fan ynterne referinsjegen yn kontrôlegroep
Δct eksperimintele groep = ct wearde fan it doelgen yn 'e eksperimintele groep - ct wearde fan it ynterne referinsjegen yn 'e eksperimintele groep
ΔΔct=Δct eksperimintele groep-Δct kontrôle groep
Uteinlik berekkenje it meardere fan ferskil yn ekspresjenivo:
Fold feroarje = 2-ΔΔct (oerienkommende mei de excel-funksje is POWER)
Relatearre produkten:
Post tiid: mei-20-2023
