Tradysjonele reverse transkriptases kinne gjin hege temperatueren tolerearje (de optimale temperatuer foar MMLV-aktiviteit is 37-50 ° C, en AMV is 42-60 ° C).De mear komplekse virale RNA kin net effektyf omkearde transkribearre yn cDNA by lege temperatueren, resultearret yn opspoaren effisjinsje De reduksje.Tradisjoneel RT-qPCR fereasket algemien de dielname fan twa wichtige enzymen (reverse transkriptase en DNA-polymerase), wêrtroch it ûnmooglik is om de wurking fan it reaksjesysteem te ferienfâldigjen en de kosten te ferminderjen.Hjir sille wy twa hege temperatuer-resistinte reverse transkriptases yntrodusearje, TtH en RevTaq.Dizze twa enzymen hawwe ek de funksje fan DNA-polymerase, dus wurde se bifunksjonele enzymen neamd.

TtH DNA polymerase

Jo moatte hawwe heard oer TtH, dat is ôflaat fan de thermophilic baktearje Thermus thermophilus HB8.Yn 'e oanwêzigens fan divalente kationen lykas Mg2+ hat it DNA-polymerase-aktiviteit.It wurdt in soad brûkt yn PCR reaksjes lykas Taq enzyme, mar it hat hegere waarmte ferset as Taq enzyme, dus it hat ek in better effekt op PCR mei hege GC ynhâld sjabloanen.

· Dit enzyme hat yn prinsipe gjin 3′→5′ exonuclease-aktiviteit en 5′→3′ exonuclease-aktiviteit, dus it kin ek brûkt wurde foar dideoxy-sekwinsje.

· Dit enzyme hat RTase-aktiviteit.Yn 'e oanwêzigens fan Mn2+ sil RTase-aktiviteit wurde fersterke.Mei dizze funksje kin it brûkt wurde om omkearde transkripsje-reaksje en PCR-reaksje út te fieren yn deselde buis, dat is ien-stap RT-PCR.Yn 'e oanwêzigens fan Mn2+ is de krektens fan RT-PCR lykwols net heech.RT aktiviteit hat neat te krijen mei rnaase H aktiviteit.

· De ferhege aktiviteit fan Tth-DNA-polymerase (pH9, optimum +55℃～+70℃, maksimum +95℃) oerwint de problemen feroarsake troch RNA-sekundêre struktuer.It resultearjende cDNA kin wurde fersterke troch PCR mei itselde enzyme yn 'e oanwêzigens fan Mg2+-ionen.

· It fermogen fan Tth-DNA-polymerase om omkearde transkripsje en DNA-amplifikaasje by hege temperatueren út te fieren makket dit enzym nuttich foar kwantitative RT-PCR, klonearjen en genekspresje-analyze fan sellulêre en virale RNA.
· Tth-DNA-polymerase wurdt brûkt foar RT-PCR om RNA oant 1kb te fersterkjen.

Funksjes en foardielen

Tth DNA polymerase:

• Soargje foar de optimisearre polymeraseketenreaksje (PCR) produktgrutte, op syn minst 1000 bp yn 'e RT-PCR-reaksje

• Akseptearje modifisearre deoxyribonucleoside triphosphate as substraat

• Net besibbe oan RNase H aktiviteit

• Hat hege thermyske stabiliteit om problemen te oerwinnen, meastentiids yn ferbân mei de hege sekundêre struktuer oanwêzich yn RNA

RevTaq RT-PCR DNA polymerase

In waarmte-resistint DNA-polymerase mei reverse transkriptase-aktiviteit

RevTaq-RT-PCR-DNA-polymerase is in manipulearre, heul waarmtebestindich, dual-funksjoneel enzyme mei reverse transkriptase en DNA-polymerase-aktiviteiten krigen troch rjochte en keunstmjittige evolúsje.

· De heale-libben fan RevTaq RT-PCR DNA-polymerase by 95 ° C is grutter as 40 minuten.

· RevTaq RT-PCR DNA polymerase lit hege-temperatuer reverse transkripsje direkt út de RNA sjabloan, en de reverse transkripsje stap kin wurde werhelle meardere kearen te generearjen mear cDNA sjabloanen.

· RevTaq RT-PCR DNA-polymerase lit "nul-stap" RT-PCR (gjin isothermyske omkearde transkripsjestap), om't yn 'e sykliske PCR-útwreidingstap, omkearde transkripsje en DNA-amplifikaasje tagelyk foarkomme.Dit befoarderet ek de omkearde transkripsjereaksje by hege temperatueren, en minimalisearret dêrmei de problemen dy't tsjinkomme by it smelten fan de sterke sekundêre struktuer yn RNA by hege temperatueren.

· Troch de aptamer-basearre hot-startformule sil RevTaq RT-PCR DNA-polymerase bettere resultaten produsearje as de annealing- en útwreidingstemperatuer heger is as 57 ° C.

· Om't it enzyme waarmtebestindich is, is it oan te rieden om primers en probes te ûntwerpen mei heul hege smeltpunten (> 60 ° C).

· It is oan te rieden om de temperatuer fan 'e annealing / útwreidingsstap te optimalisearjen troch in temperatuergradient tidens it proses fan it opsetten fan' e reaksje.

· Hoe heger de temperatuer, hoe heger de spesifisiteit fan PCR.De omkearde transkripsje-syklus wurdt meastentiids útfierd op in hegere temperatuer as de PCR-syklus, om't DNA Primer:RNA Template-hybridisaasje meastentiids in hegere smeltpunt hat as DNA Primer:cDNA Template-dupleks.

· RevTaq RT-PCR DNA polymerase is genetysk manipulearre en optimalisearre, en de amplicon grutte is tusken 60-300 bp.

RevTaq RT-PCR DNA-polymerase-deteksjelimyt berikt 4 eksimplaren /

De optimalisearre reaksje systeem (de oprjochting fan hege smeltpunt primers) wurdt werjûn yn de figuer.RevTaq RT-PCR DNA-polymerase-oandreaune RT-PCR toant bettere gefoelichheid as TaqPath 1-stap RT-qPCR mastermix, en legere deteksje Sample dilution gradient.

Mear foardielen:

Fluchstartfunksje → De earste thermyske denaturaasjestap kin oerslein wurde.

Hot-start aptamer formule → Jou 100% enzymaktiviteit fuortendaliks en foarkomme net-spesifike amplifikaasje by lege temperatueren (<57 ° C).

Cleavage-funksje → De RNA-ekstraksjestap wurdt weilitten, om't RevTaq RT-PCR DNA-polymerase ek rûge reaksjemonsters kin ferwurkje.It kin de selmembranen fan eukaryoten, baktearjes en firussen fuortendaliks ferneatigje yn in heule RT-PCR-syklus.

IVD grûnstofnivo → hege kwaliteitsnoarmen en ekstreem konkurrearjende prizen