Fluorescence kwantitative PCR (ek bekend as TaqMan PCR, hjirnei oantsjutten as FQ-PCR) is in nije nucleic acid kwantitative technology ûntwikkele troch PE (Perkin Elmer) yn 'e Feriene Steaten yn 1995. Dizze technology is basearre op konvinsjonele PCR troch tafoeging fan fluorescent markearre probes.Yn ferliking mei fleksibele PCR hat FQ-PCR in protte foardielen om syn kwantitative funksje te realisearjen.Dit artikel is fan doel de skaaimerken, prinsipes, metoaden en tapassingen fan 'e technology koart te beskriuwen.
1 Features
FQ-PCR hat net allinnich de hege gefoelichheid fan gewoane PCR, mar ek fanwege de tapassing fan fluorescent sondes, it kin direkt detect de feroaring fan fluorescent sinjaal tidens PCR amplification fia de photoelectric conduction systeem te krijen kwantitative resultaten, dy't oerwint in protte tekoartkommingen fan konvinsjonele PCR, dus it hat ek de hege spesifisiteit fan DNA hybridization en hege spesifisiteit fan hybride technology.
Bygelyks, algemiene PCR-produkten moatte wurde waarnommen troch agarosegelelektroforese en ethidiumbromide-kleuring mei ultraviolet ljocht of troch polyacrylamide-gelelektroforese en sulverkleuring.Dit fereasket net allinich meardere ynstruminten, mar kostet ek tiid en muoite.De vlekken brûkt Ethidium bromide is skealik foar it minsklik lichem, en dizze yngewikkelde eksperimintele prosedueres jouwe kânsen foar fersmoarging en falske positiven.FQ-PCR moat lykwols mar ien kear it deksel iepenje by it laden fan monsters, en it folgjende proses is folslein sletten buis operaasje, dy't gjin PCR-postferwurking nedich is, en in protte neidielen yn konvinsjonele PCR-operaasjes foarkomme.It eksperimint brûkt yn 't algemien de ABI7100 PCR-thermyske fytser ûntwikkele troch PE-bedriuw.
It ynstrumint hat de folgjende skaaimerken: ① Wide tapassing: It kin brûkt wurde foar DNA en RNA PCR produkt kwantifikaasje, gene ekspresje ûndersyk, patroan opspoaren, en optimalisearjen fan PCR betingsten.② Unyk kwantitatyf prinsipe: Mei help fan fluorescent markearre probes sil de hoemannichte fluoreszinsje accumulearje mei de PCR-syklus nei laser-eksitaasje, om it doel fan kwantifikaasje te berikken.③ Hege wurkjende effisjinsje: Ynboude 9600 PCR termyske cycler, komputer kontrolearre 1 oant 2 oeren om de amplifikaasje en kwantifikaasje fan 96 samples automatysk en syngroan te foltôgjen.④ Gjin needsaak foar gelelektroforese: Gjin needsaak om it stekproef te verdunnen en elektroforese te meitsjen, brûk gewoan in spesjale sonde om direkt yn 'e reaksjebuis te ûntdekken.⑤Gjin fersmoarging yn 'e pipeline: De unike folslein ôfsletten reaksjebuis en fotoelektrysk geleidingssysteem wurde oannommen, dus d'r is gjin need om soargen te meitsjen oer fersmoarging.⑥De resultaten binne reprodusearber: it kwantitative dynamyske berik is oant fiif oarders fan grutte.Dêrom, sûnt dizze technology is mei súkses ûntwikkele, is it wurdearre troch in protte wittenskiplike ûndersikers en is tapast op in protte fjilden.
2 Prinsipes en metoaden
It wurkprinsipe fan FQ-PCR is om de 5′→3′ exonuclease-aktiviteit fan Taq-enzyme te brûken om in fluorescent markearre probe ta te foegjen oan it PCR-reaksjesysteem.De sonde kin spesifyk hybridisearje mei it DNA-sjabloan befette yn 'e primersekwinsje.It 5'-ein fan 'e probe is markearre mei it fluorescence-emisje-gen FAM (6-carboxyfluorescein, fluorescence-emisje-peak by 518nm), en it 3'-ein is markearre mei The fluorescence quenching group TAMRA (6-carboxytetramethylpeak-rhodamine), de probe wurdt phosphorylearre om foar te kommen dat de probe ferlingd wurdt by PCR-amplifikaasje.As de sonde yntakt bliuwt, ûnderdrukt de quencher-groep de fluorescence-emisje fan 'e emittearjende groep.Sadree't de emittearjende groep is skieden fan de quenching groep, de ynhibysje wurdt opheft, en de optyske tichtens by 518nm ferheget en wurdt ûntdutsen troch de fluorescence detection systeem.As de sonde ôfsnien is, wurdt it quenching-effekt frijlitten en wurdt it fluorescent sinjaal frijlitten.Elke kear as it sjabloan wurdt kopiearre, wurdt in sonde ôfsnien, begelaat troch de frijlitting fan in fluorescent sinjaal.Om't d'r in ien-op-ien relaasje is tusken it oantal frijlitten fluorofoaren en it oantal PCR-produkten, kin dizze technyk brûkt wurde om it sjabloan sekuer te kwantifisearjen.It eksperimintele ynstrumint brûkt yn 't algemien de ABI7100 PCR-thermyske fytser ûntwikkele troch PE-bedriuw, en oare termyske fytsers kinne ek brûkt wurde.As it ABI7700 reaksjetype reaksjesysteem wurdt brûkt foar it eksperimint, neidat de reaksje is foltôge, kinne de kwantitative resultaten direkt wurde jûn fia kompjûteranalyse.As jo oare termyske fytsers brûke, moatte jo in fluoreszensdetektor brûke om it fluoreszenssinjaal yn 'e reaksjebuis tagelyk te mjitten om RQ +, RQ-, △RQ te berekkenjen.RQ+ stiet foar de ferhâlding fan de luminescence yntinsiteit fan de fluorescent emisje groep fan de stekproef buis oan de luminescence yntinsiteit fan de quenching groep, RQ- stiet foar de ferhâlding fan de twa yn 'e lege buis, △RQ (△RQ = RQ + -RQ-) stiet foar de hoemannichte fan fluorescence-feroaring ûnder fluorescence resultaten, neidat sinjaalferoaring ûnder PCR kin wurde krigen.Troch de ynfiering fan fluorescent probes wurdt de spesifisiteit fan it eksperimint signifikant ferbettere.It probeûntwerp moat oer it algemien oan de folgjende betingsten foldwaan: ①De lingte fan 'e sonde moat sawat 20-40 bases wêze om de spesifisiteit fan bining te garandearjen.②De ynhâld fan GC-basen is tusken 40% en 60% om duplikaasje fan inkele nukleotide-sekwinsjes te foarkommen.③ Foarkom hybridisaasje of oerlaap mei primers.④ De stabiliteit fan 'e bining tusken de sonde en it sjabloan is grutter dan de stabiliteit fan' e bining tusken de primer en it sjabloan, dus de Tm-wearde fan 'e sonde moat op syn minst 5 ° C heger wêze as de Tm-wearde fan' e primer.Dêrnjonken hawwe de konsintraasje fan 'e sonde, de homology tusken de sonde en de sjabloansekwinsje, en de ôfstân tusken de sonde en de primer allegear ynfloed op de eksperimintele resultaten.
Relatearre produkten:
China Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman Fabrikant en leveransier |Foregene (foreivd.com)
Posttiid: 15 oktober 2021
