Real Time PCR, ek bekend as kwantitative PCR of qPCR, is in metoade foar real-time monitoring en analyze fan PCR-amplifikaasjeprodukten.
Om't kwantitative PCR de foardielen hat fan ienfâldige operaasje, fluch en handich, hege gefoelichheid, goede repeatability, en lege fersmoarging taryf, it wurdt in protte brûkt yn medyske testen, drug effektiviteit beoardieling, gene ekspresje ûndersyk, transgenic ûndersyk, gene detection, pathogen detection, dier en plant detection., iten testen en oare fjilden.
Dêrom, as jo dwaande binne mei basisûndersyk yn libbenswittenskippen, as meiwurkers fan farmaseutyske bedriuwen, feehâlderijbedriuwen, fiedingsbedriuwen, of sels meiwurkers fan yn--útgong-ynspeksje en karantineburo's, ôfdielingen foar miljeumonitoring, sikehûzen en oare ienheden, sille jo min of mear bleatsteld wurde oan Of jo moatte de kennis witte fan it behearjen fan kwantitative PCR.

Prinsipe fan Real Time PCR

Real Time PCR is in metoade wêryn fluorescent stoffen wurde tafoege oan de PCR reaksje systeem, en de fluorescence sinjaal yntinsiteit yn it proses fan PCR reaksje wurdt kontrolearre yn echte tiid troch in kwantitative PCR ynstrumint, en as lêste de eksperimintele gegevens wurde analysearre en ferwurke.

【Amplification kromme】is de kromme dy't it dynamyske proses fan PCR beskriuwt.De amplifikaasjekromme fan PCR is eins net in standert eksponinsjele kromme, mar in sigmoïde kromme.

[Platformfaze fan amplifikaasjekromme]Mei it tanimmen fan it oantal PCR-syklusen, de ynaktivearring fan DNA-polymerase, de útputting fan dNTP's en primers, en de ynhibysje fan 'e synteze-reaksje troch it reaksje byprodukt pyrophosphate, ensfh., Wreidet de PCR net altyd eksponentieel út., en sil úteinlik in plato yngean.

[Eksponinsjele groeiregio fan amplifikaasjekromme]Hoewol't de plateau faze fariearret sterk, yn in bepaalde regio fan 'e eksponinsjele groei regio fan' e amplification curve, de repeatability is hiel goed, dat is hiel wichtich foar kwantitative analyze fan PCR.

[Drompelwearde en Ct-wearde]Wy sette de limytwearde fan fluoreszensdeteksje op 'e passende posysje yn it eksponinsjele groeigebiet fan' e amplifikaasjekromme, nammentlik de drompelwearde (Threshold).De krusing fan 'e drompelwearde en de amplifikaasjekromme is de Ct-wearde, dat is, de Ct-wearde ferwiist nei it oantal syklusen (Threshold Cycle) as de drompelwearde wurdt berikt.

De grafyk hjirûnder toant dúdlik de relaasje tusken drompelline en amplification curve, drompel en Ct wearde.

【Hoe kwantifisearje?】

It is bewiisd troch wiskundige teory dat de Ct wearde hat in omkearde lineêre relaasje mei de logaritme fan it oantal initial sjabloanen.Real Time PCR kontrolearret PCR-amplifikaasjeprodukten yn realtime en kwantifisearret se tidens de eksponinsjele amplifikaasjefaze.

Foar elke syklus fan PCR ferhege it DNA eksponentiell mei 2 kear, en berikte al gau in plato.

Oannommen dat de hoemannichte start-DNA A is₀ , nei n syklusen, kin de teoretyske hoemannichte DNA-produkt wurde útdrukt as:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Dan, hoe mear it inisjele DNA-bedrach A 0 is, hoe earder it bedrach fan it fersterke produkt de deteksjewearde An berikt, en it oantal syklusen by it berikken fan An is de Ct-wearde.Dat is, hoe mear it inisjele DNA-bedrach A 0 is, hoe earder de peaks fan de amplifikaasjekromme peaks, en it oerienkommende oantal syklusen n is lytser.

Wy fiere gradient dilution fan 'e standert fan bekende konsintraasje en brûke it as sjabloan foar Real Time PCR, en in rige fan amplification curves sille wurde krigen op gelikense yntervallen yn' e folchoarder fan begjinnende DNA bedrach fan mear nei minder.Neffens de lineêre relaasje tusken de Ct wearde en de logaritme fan it oantal begjinnende sjabloanen, a[standert kromme] kin oanmakke wurde.

Troch it ferfangen fan de Ct wearde fan de stekproef mei ûnbekende konsintraasje yn de standert kromme, kin de earste sjabloan bedrach fan 'e stekproef mei ûnbekende konsintraasje krije, dat is it kwantitative prinsipe fan Real Time PCR.

Detection metoade fan Real Time PCR

Real Time PCR detektearret PCR-amplifikaasjeprodukten troch de fluorescinsje-yntensiteit yn it reaksjesysteem te detektearjen.

Prinsipe fan Fluorescent Dye Embedding Method】

Fluorescent kleurstoffen, lykas TB Green ® , kin net-spesifyk bine oan dûbelstrengige DNA yn PCR-systemen en fluoressje by bining.

De fluorescensintensiteit yn it reaksjesysteem ferhege eksponentiell mei de tanimming fan PCR-syklusen.Troch it opspoaren fan de fluorescence yntinsiteit, it bedrach fan DNA amplification yn de reaksje systeem kin wurde kontrolearre yn it echt tiid, en dan kin it bedrach fan it begjinpunt sjabloan yn de stekproef wurde omkearde rûsd.

【Prinsipe fan fluorescent probe metoade】

fluorescent sondeis in nucleic acid folchoarder mei in fluorescent groep oan de 5 'ein en in quenching groep oan' e 3 'ein, dat kin spesifyk bine oan it sjabloan.As de sonde yntakt is, wurdt de fluoreszinsje dy't troch de fluorofoar útstjitten wurdt útsteld troch de quenching-groep en kin net fluoressjeare.As de sonde wurdt ûntbûn, sil de fluorescent stof dissociate en emit fluorescence.

In fluorescent probe wurdt tafoege oan de PCR-reaksje-oplossing.Tidens it annealingproses sil de fluorescent probe bine oan 'e spesifike posysje fan' e sjabloan.Tidens it útwreidingsproses kin de 5′→3′ exonuclease-aktiviteit fan it PCR-enzyme de fluorescent probe dy't hybridisearre is mei it sjabloan ûntbrekke, en de fluorescent stof wurdt dissociated om fluoreszinsje út te stjoeren.Troch de fluorescinsje-yntensiteit fan 'e sonde yn it reaksjesysteem te detektearjen, kin it doel fan it kontrolearjen fan it amplifikaasjebedrach fan it PCR-produkt berikt wurde.

【Seleksje fan Fluorescence Detection Metoade】

As it wurdt brûkt om sekwinsjes te ûnderskieden mei hege homology en multiplex PCR-deteksje út te fieren lykas SNP-typeanalyse, is de fluorescent probemetoade ûnferfangber.
Foar oare Real Time PCR-eksperiminten kin in ienfâldige, maklike en lege kosten fluorescent chimera-metoade wurde brûkt.

probesSterke spesifisiteit, by steat fan multiplex PCR

Tekoart

Hege spesifisiteit easken foar amplification;

multiplex PCR kin net wurde útfierd Need te ûntwerpen spesifike probes, hege kosten;

soms probe design is dreech

Relatearre produkten: