RT-qPCR eksperimint omfiemet RNA ekstraksje en kwaliteit beoardieling, reverse transkripsje en qPCR trije stappen, elke stap hat in protte foarsoarchsmaatregels, wy sille yntrodusearje yn detail hjirûnder.

Ⅰ.RNA kwaliteit beoardieling

Yn RT-qPCR-eksperimint, nei it foltôgjen fan RNA-ekstraksje, moat de kwaliteit fan RNA wurde evaluearre, en it folgjende eksperimint kin allinich útfierd wurde nei't it kwalifisearre is.Evaluaasjemetoaden omfetsje spektrofotometer, Agilent gelelektroforese, Agilent 2100-analyse, wêrûnder de meast brûkte spektrofotometer en deteksje fan agarosegelelektroforesemetoade.It moat opmurken wurde dat dizze twa metoaden tegearre moatte wurde brûkt om de deteksje en analyze fan RNA-konsintraasje, suverens en yntegriteit te foltôgjen, om de kwaliteit fan RNA te garandearjen.

Related RNA Isolation Kit: 

Sel Totaal RNA Isolaasje Kit

Heech suvere en heechweardige totale RNA kin yn 11min wurde krigen fan ferskate kweekte sellen.

Animal Totaal RNA Isolaasje Kit

Fluch en effisjint ekstrahearje hege suverens en heechweardich totale RNA út ferskate dierlike weefsels.

Spektrofotometer:

De spektrofotometer wurdt benammen brûkt om de konsintraasje en suverens fan RNA te bepalen, mar it kin de yntegriteit fan RNA en genomysk residu net detektearje.Under harren binne A260/280 en A260/230 wichtige parameters foar deteksje fan RNA-suverens, en RNA-suverens kin wurde ûntdutsen neffens de fluktuaasje fan har wearden:

1. 1.9 2.1, wat oanjout mooglik foar in part degradaasje fan RNA, dat kin fierder befêstige wurde troch agarose gel electrophoresis.

2. 2.0

Agarose gel elektroforese:

Agarose gel electrophoresis assay kin analysearje RNA yntegriteit, genome en aaiwyt residuen, mar kin net sekuer kwantifisearje de konsintraasje fan RNA of detect de resten fan organyske reagents.Nim bygelyks eukaryote RNA-sjabloanen:

1. De RNA waard ûnderwurpen oan agarose gel electrophoresis.As d'r mar trije inkele bands fan 28sRNA, 18sRNA en 5.8sRNA wiene op 'e gelkaart, jout it oan dat it ekstrahearre RNA yntakt is.As d'r in slepend ferskynsel is, jout it oan dat in part degradaasje fan RNA is.

2. As der in inkele heldere band tusken de lijm gat en de 28sRNA band, der kin wêze genomic DNA residu.

3. As bands ferskine yn it lijm gat, it jout oan dat der kin wêze resten fan aaiwyt en oare macromolecular stoffen.

Ⅱ. Omkearde transkripsje

Nei't RNA-ekstraksje is foltôge, moat it wurde omkeard yn cDNA foar folgjende eksperiminten, sadat de omkearstap essensjeel is.Omkearde transkripsje sil wurde yntrodusearre út 'e seleksje fan reverse transkriptase en primer:

Seleksje fan reverse transkriptase:

De typyske reverse transkriptases omfetsje AMV RTase en MMLV RTase.De RNase H fan AMV RTase hat sterke aktiviteit, koarte synteze lingte, lege synteze bedrach en goede termyske stabiliteit (42 ~ 55 ℃).De RNase H aktiviteit fan MMLV RTase is swak, de synteze lingte is lang, it synteze bedrach is heech, en de termyske stabiliteit is min (37 ~ 42 ℃).

Om't RNase H-enzyme de funksje hat fan it ôfbrekken fan RNA-sjabloan, moat MMLV mei swakke RNase H-aktiviteit by foarkar selektearre wurde by omkearde transkripsje, en nei letter genetyske technyk hat de thermyske stabiliteit fan MMLV in kwalitative sprong berikt.Taking ForegeneForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV foar reverse transkripsje) as foarbyld, it is in nije reverse transkriptase útdrukt yn E. coli manipulearre baktearjes mei help fan genetyske rekombinaasje technology.It is in rekombinante DNA-polymerase dy't in komplemintêre DNA-string syntetisearret fan ienstrengige RNA, DNA, as in RNA:DNA-hybride.It hat gjin RNase H-aktiviteit, sterke stabiliteit, sterke RNA-affiniteit, en hege deteksjesensitiviteit.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV foar reverse transkripsje)

Seleksje fan primer:

Algemien falle RT-primers yn trije kategoryen: oligo dT, willekeurige primers, en gen-spesifike primers.Selektearje passende primers foar gebrûk neffens ferskate eksperimintele easken.

1. As it sjabloan fan eukaryotyske oarsprong is en it lette cDNA wurdt brûkt foar routine PCR-amplifikaasje, wurdt Oligo (dT) oanrikkemandearre;As it folgjende eksperimint allinich brûkt wurdt foar qPCR, wurdt Oligo (dT) oanrikkemandearre om te mingd mei willekeurige primers om de effisjinsje fan reverse transkripsje te ferbetterjen.

2. As de sjabloan is út prokaryotes, Random Primers of gene spesifike primers moatte wurde selektearre foar reverse transkripsje.

Ⅲ.qPCR

Fluorescence kwantifikaasje wurdt benammen útwurke út de seleksje fan kwantitative metoaden, primer design prinsipes, ROX seleksje, reaksje systeem konfiguraasje en reaksje betingsten ynstelling, ensfh.

Seleksje fan kwantitative metoaden:

Kwantitative metoaden wurde ferdield yn relative kwantitative metoaden en absolute kwantitative metoaden.Relative kwantifikaasje kin brûkt wurde om it effekt fan bepaalde behannelingmetoaden op geneekspresje te detektearjen, it ferskil fan genekspresje op ferskate tiden te detektearjen en it ferskil fan geneekspresje yn ferskate weefsels te fergelykjen.Absolute kwantifikaasje kin de hoemannichte nukleïnesûr yn it firus detektearje en sa fierder.By it dwaan fan eksperiminten moatte wy de passende kwantitative metoaden kieze neffens ús eigen eksperiminten.

Primer ûntwerpprinsipes:

It ûntwerp fan primer foar qPCR is direkt relatearre oan de amplifikaasje-effisjinsje en produktspesifisiteit.Dêrom is it korrekt ûntwerpen fan goede primers de earste stap fan suksesfolle qPCR.By it ûntwerp fan primer moatte de folgjende prinsipes omtinken wurde by it foldwaan oan it prinsipe fan konvinsjonele primerûntwerp:

1. De lingte fan it doelfragmint wurdt kontrolearre tusken 100 en 300 bp;

2. Cross-exon-ûntwerp om de ynfloed fan genomysk DNA te foarkommen;

3. De ûntwurpen primers moatte wurde hifke foar amplification effisjinsje, en allinnich as de amplification effisjinsje berikt de standert (90-110%) kinne se brûkt wurde foar kwantitative eksperiminten;

4. Primer konsintraasje wurdt meastal optimalisearre tusken 0.1uM en 1.0uM.

Seleksje fanROX:

Yn it proses fan kwantitative reaksje, ROX kin oanpasse it optyske paad ferskil, pipetting flater of folume ferskil feroarsake troch ferdamping en kondensaasje uniformly, ferbetterjen fan de repeatability fan de resultaten.It moat lykwols opmurken wurde dat de seleksje fan ROX is besibbe oan it ynstrumint.As it qPCR-ynstrumint de funksje hat om it ferskil tusken gatten automatysk te korrigearjen, hoecht it ROX net ta te foegjen;oars, it moat tafoegje ROX korreksje.Lytse partners by it keapjen fan reagents moatte wêze neffens it ynstrumint dat wurdt brûkt om de juste ROX te kiezen, foarkom letter flaters.

Tarieding fan reaksje systeem:

Reaksjevolumes fan 20ul en 50ul hawwe de foarkar.By it opstellen fan it systeem moatte de folgjende saken omtinken jûn wurde:

1. It reaksjesysteem moat wurde taret troch fentilaasje yn 'e ultra-skjinne wurkbank, nije ddH₂O wurdt brûkt foar elk eksperimint;

2. Elke eksperimint moat NTC tariede om te kontrolearjen oft der fersmoarging is yn it systeem, en elke pear primers moat NTC dwaan by it tarieden fan it systeem;

3. Om te detektearjen oft der gDNA-residu is yn 'e RNA-sjabloan, kin NRT foar elke stekproef foar detectie wurde taret;

4. By it tarieden fan it systeem is it oan te rieden om op syn minst 3 technyske werhellingen te dwaan foar ien stekproef;

5. As it sjabloan cDNA is, wurdt it oanrikkemandearre om 5-10 kear te verdunnen om it ynhibysje-effekt fan reverse-transkripsjesysteem op qPCR-eksperimint te ferminderjen.It is better om te ferkennen de sjabloan kwantiteit troch gradient, sadat de CT wearde falt tusken 20-30;

6. Bepale it fereaske oantal reaksjes, ferheegje mei 5-10% op basis fan it oantal reaksjes, en berekkenje it folume konfiguraasjenûmer;

7, it systeem wurdt taret mei it premix-prinsipe, mingen nei sintrifugaasje en soargje foar gjin bubbels;

8, Sa fier mooglik te kiezen stypjende verbruiksartikelen.

Related RT-qPCR Kit