Spesifisiteit fan deteksje
Yn 'e measte gefallen is it doel fan primerûntwerp om de spesifisiteit fan PCR te maksimalisearjen.Dit wurdt bepaald troch de min of mear foarsisbere ynfloed fan in protte fariabelen.Ien wichtige fariabele is de folchoarder oan 'e 3'-ein fan' e primer.
Wichtich binne PCR-assays ûntworpen foar spesifisiteit mear kâns om hege effisjinsje te behâlden oer in breed dynamysk berik, om't de assay gjin net-spesifike amplifikaasjeprodukten produseart, en dêrmei konkurrearje mei PCR-reagenzjes of de wichtichste amplifikaasjereaksje remme.
Fansels is yn guon gefallen spesifisiteit net it wichtichste, bygelyks as it doel is om nau besibbe te kwantifisearjen, mar ferskate patogenen, spesjale ûntwerp-, optimisaasje- en ferifikaasjenormen binne ferplicht.
De smeltkurve is in standertmetoade foar it beoardieljen fan de spesifisiteit fan amplicons, teminsten yn termen fan it fersterkjen fan in inkeld doel.It moat lykwols beklamme wurde dat de smeltkurven misliedend wêze kinne, om't se bygelyks beynfloede wurde kinne troch de kombineare effekten fan suboptimale primers en lege sjabloankonsintraasjes.
P5 |De smeltkurve toant de Tm-feroarings krigen fan twa deteksjes fan ferskillende hoemannichten fan twa doel-DNA's.
A. By hegere konsintraasjes (ad)) is der gjin dúdlike primerdimer neidat de qPCR-mjitting foltôge is.As de sjabloan konsintraasje nimt ôf oan 50 eksimplaren (e), begjint in net-spesifike produkt te ferskinen en wurdt it ienige produkt op 'e leechste konsintraasje (f).
B. De test registrearre deselde Tms op alle doel konsintraasjes, en der wie gjin dúdlik primer dimer sels by de leechste konsintraasje (5 kopyen).By it brûken fan dizze twa deteksjemetoaden waarden gjin amplifikaasjeprodukten ûntdutsen yn NTC's.
P5 toant de ûntbiningskurven krigen mei samples wêryn it sjabloan oanwêzich is by ferskate konsintraasjes.P 5a lit sjen dat by de twa leechste konsintraasjes de Tms fan 'e produsearre net-spesifike amplifikaasjeprodukten leger binne as dy fan 'e spesifike amplicons.
Fansels kin dizze deteksjemetoade net betrouber wurde brûkt om doelen te detektearjen dy't besteane yn lege konsintraasjes.
Ynteressant hawwe NTC's, dat wol sizze, samples sûnder DNA, gjin (net-spesifike) amplifikaasjeprodukten opnommen, wat oanjout dat eftergrûngenomysk DNA kin meidwaan oan net-spesifike amplifikaasje / polymerisaasje.
Soms sokke eftergrûn primers en net-spesifike amplification kin net remedied, mar it is faak mooglik om te ûntwerpen in detection metoade dy't net hawwe net-spesifike amplification yn alle template konsintraasje en NTC (P 5b).
Hjir, sels it opnimmen fan de amplifikaasje fan 'e doelkonsintraasje mei in Cq fan 35 sil in spesifike ûntbiningskromme produsearje.Op deselde manier lieten NTC's gjin tekens sjen fan net-spesifike amplifikaasje.Soms kin it deteksjegedrach ôfhinklik wêze fan 'e memmedrank, en allinich net-spesifike amplifikaasje wurdt ûntdutsen yn bepaalde bufferkomposysjes, dy't relatearre wurde kinne oan ferskate Mg2+ konsintraasjes.
Stabiliteit fan deteksje
De optimisaasje fan Ta is in nuttige stap yn it empiryske ferifikaasje- en optimisaasjeproses fan qPCR-deteksje.It jout in direkte yndikaasje fan 'e robústiteit fan' e primer-set troch de temperatuer (of temperatuerberik) te sjen dy't de leechste Cq produsearret sûnder de NTC te fersterkjen.
It twa oant fjouwer kear ferskil yn gefoelichheid kin net wichtich wêze foar minsken mei hege mRNA-ekspresje, mar foar diagnostyske tests kin it it ferskil betsjutte tusken positive en falsk negative resultaten.
De Ta-eigenskippen fan qPCR-primers kinne sterk ferskille.Guon tests binne net hiel robúst, en as se net útfierd ûnder de optimale Ta wearde fan de primers, se sille fluch ynstoarten.
Dit is wichtich om't dit soarte fan deteksje faaks problematysk is yn 'e echte wrâld, en de suverens fan' e stekproef, de konsintraasje fan DNA, of de oanwêzigens fan oare DNA kin net optimaal wêze.
Dêrneist kin it doelkopynûmer yn in breed berik fariearje, en de reagentia, plestik gebrûksfoarwerpen of ynstruminten kinne oars wêze as dy brûkt wurde by it ynstellen fan de test.
P6|De temperatuergradient toant de ferskillende robuustheid fan PCR-deteksje.
A. Brûk Bioline's Sensifast SYBR mastermix (katalogusnûmer BIO-98050) om PCR út te fieren op cDNA taret út minsklike harsens RNA.
B. Brûk Bio-Rad's CFX qPCR-ynstrumint om de amplifikaasjekaart en ûntbiningskromme fan apalene op te nimmen (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Amplification grafyk en melting kromme fan ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Amplification grafyk en ûntbining kromme fan GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs opnommen op ferskillende annealing temperatueren, showing it ferskil yn Cq opnommen ûnder in 7C temperatuer gradient.
P 6 lit in typysk resultaat fan in net winske test, dêr't qPCR waard útfierd mei help fan in gradient Tas tusken 59C en 67C (P 6a), mei help fan primers foar trije minsklike brein-spesifike genen.
It kin sjoen wurde út de amplification grafyk dat Opalin primers binne fier fan ideaal omdat harren optimale Ta berik is hiel smel (figuer 6b), dat is, Cqs binne wiidferspraat, resultearret yn Cqs wurde signifikant fergelike mei harren optimale Cqs Low.
Dizze deteksjemetoade is ynstabyl en kin liede ta suboptimale amplifikaasje.Dêrom moat dit pear primers opnij wurde ûntwurpen.Dêrnjonken lit de melting curve analyze (ynset) sjen dat de spesifisiteit fan dizze deteksjemetoade ek problematysk wêze kin, om't de melting curve fan elke Ta oars is.
De ACSBG1-deteksjemetoade werjûn yn P 6c is robúster as de Opalin-deteksjemetoade hjirboppe, mar it is noch fier fan ideaal, en it is wierskynlik dat it kin wurde ferbettere.
Wy beklamje lykwols dat d'r gjin needsaaklike ferbining is tusken robustens en spesifisiteit, om't de ûntbiningskromme produsearre troch dizze deteksjemetoade deselde pykwearde yn alle Tas (ynset).
Oan 'e oare kant is de robustness test folle toleranter, produsearret ferlykbere Cqs yn in breed skala oan Tas, lykas yn de GFAP test werjûn yn P 6d.
It ferskil yn Cqs krigen yn deselde 8 graden Celsius berik is minder as 1, en de ûntbining kromme (ynset) befêstiget de deteksje skaaimerken yn dit temperatuer berik.It is de muoite wurdich opskriuwen dat de berekkene Tas en it eigentlike Ta berik kin wêze hiel oars.
D'r binne in protte rjochtlinen ûntworpen om ûndersikers te helpen by it ûntwerpen fan effisjinte primers, wêrfan de measte binne basearre op lang fêststelde regels en in protte omtinken is betelle oan 'e 3'-ein fan' e primers.It wurdt faak oan te rieden om in G of C op 'e 3' ein en twa G of C bases (GC clamp), mar net mear as twa fan de lêste 5 bases.
Yn 'e praktyk kinne dizze regels ûndersikers liede, mar se binne net needsaaklik ûnder alle omstannichheden korrekt.
P7 |It 3'-ein fan 'e primer hat net folle effekt op spesifisiteit of effisjinsje.
A. De posysje fan 'e primers foar it minsklike HIF-1α (NM_181054.2) gen.
B. Brûk Agilent Brilliant III SYBR Griene mem liquor (Cat. No. 600882) foar in fersterkjen seis test items.
C. Amplification grafyk en melting kromme opnommen troch Bio-Rad syn CFX qPCR ynstrumint en 3'end primers.NTC's wurde yn read toand.
D. Cqs rekord fan elk test item
Bygelyks, it resultaat yn P 7 tsjinsprekt de 3'-ein regel.Alle ûntwerpen produsearje yn prinsipe deselde resultaten, mei mar twa primer kombinaasjes dy't liede ta net-spesifike amplification yn NTC.
Wy kinne lykwols it effekt fan 'e GC-klip net stypje, om't yn dit gefal A of T as maksimaal 30-basen brûke net spesifisiteit ferminderje.
Test C, wêr't de F-primer einiget yn GGCC, hat Cq's opnommen yn NTC's, wat oanjout dat men dizze sekwinsjes miskien wol foarkomme wolle oan 'e 30-ein.Wy beklamje dat de iennichste manier om de bêste 3'end-sekwinsje fan in primerpaar te bepalen is om guon kandidaat-primers eksperiminteel te evaluearjen.
Amplification effisjinsje
Wichtich, hoewol net-spesifike PCR-deteksje nea spesifyk kin wurde, kin de amplifikaasje-effisjinsje op in protte ferskillende manieren oanpast en maksimalisearre wurde troch it feroarjen fan it enzyme, memmelike drank, additieven en fytsbetingsten.
Om de effisjinsje fan PCR-deteksje te evaluearjen, is it it bêste om in seriële verdunning te brûken fan 10 of 5 kear it doelnukleinsûr, dat is de "standert krommemetoade".
As PCR-amplikons of syntetyske DNA-doelen wurde brûkt om in standertkromme te generearjen, moatte serial dilutions fan dizze doelen wurde mingd mei in konstante hoemannichte eftergrûn-DNA (lykas genomysk DNA).
P8 |Verdunningskurve om de effisjinsje fan PCR te evaluearjen.
A. Brûk primers foar HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA en R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC en Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (katalogusnûmer 600882) foar PCR- en meltingkurvebetingsten.
B. 100 ng RNA waard omkearde transkribearre, 2 kear verdund, en serial verdunde cDNA-samples waarden 5 kear verdund nei 1 ng minsklik genomysk DNA.De smeltkurve wurdt werjûn yn 'e ynset.
C. De RT-reaksje, ferwidering en seriële ferwidering waarden werhelle foar it twadde cDNA-monster, en de resultaten wiene ferlykber.
P 8 toant twa standert krommes, mei deselde deteksjemetoade op twa ferskillende cDNA-samples, it resultaat is deselde effisjinsje, sawat 100%, en de R2-wearde is ek ferlykber, dat is de graad fan fit tusken de eksperimintele gegevens en de regressionline of de gegevens Degree of linearity.
De twa standert krommes binne fergelykber, mar net krekt itselde.As it doel is om it doel sekuer te kwantifisearjen, moat it opmurken wurde dat it net akseptabel is om in kopynûmerberekkening te leverjen sûnder de ûnwissichheid te ferklearjen
P9 |Meting ûnwissichheid ferbûn mei kwantifikaasje mei help fan in standert kromme.
A. Brûk primers foar GAPDH (NM_002046) foar in útfiere PCR en melting curve betingsten.F: ACAGTTGCCATGTAGACC en R: TAACTGGTTGAGCACAGG en Bioline's Sensifast SYBR mastermix (katalogusnûmer BIO-98050).
B. Amplification chart, melting kromme en standert kromme opnommen mei Bio-Rad syn CFX qPCR ynstrumint.
C. Standert kromme grafyk en 95% fertrouwen ynterval (CI).
D. It kopynûmer en 95% betrouwensinterval fan 'e trije Cq-wearden dy't ôflaat binne fan' e verdunningskurve.
P 9 lit sjen dat foar in optimalisearre test, de ynherinte fariabiliteit fan in inkele standert kromme is likernôch 2 kear (95% fertrouwen ynterval, minimum oant maksimum), dat kin wêze de lytste fariabiliteit dat kin wurde ferwachte.
Related produkt:
Post tiid: Sep-30-2021
