RT-qPCR is ûntwikkele út gewoane PCR technology.It foeget fluorescente gemikaliën (fluorescent kleurstoffen as fluorescent probes) ta oan it tradisjonele PCR-reaksjesysteem, en detektearret it PCR-annealing- en útwreidingsproses yn realtime neffens har ferskillende luminescentmeganismen.Fluorescent sinjaal feroarings yn it medium wurde brûkt om te berekkenjen it bedrach fan produkt feroaring yn elke syklus fan PCR.Op it stuit binne de meast foarkommende metoaden fluorescent kleurstofmetoade en probemetoade.

Fluorescent kleurstof metoade:
Guon fluorescent kleurstoffen, lykas SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, ensfh, emit gjin ljocht troch harsels, mar emit fluorescence nei bining oan de lytse groove fan dsDNA.Dêrom, oan it begjin fan 'e PCR-reaksje, kin de masine it fluorescent sinjaal net detektearje.As de reaksje trochgiet nei de annealing-útwreiding (twa-stapmetoade) of útwreidingsstadium (trije-stapmetoade), wurde de dûbele stringen op dit stuit iepene, en de nije DNA-polymerase Tidens strandsynteze wurde fluorescent molekulen kombineare yn 'e dsDNA-lytse groove en emitearje fluoreszinsje.As it oantal PCR-syklusen ferheget, kombinearje mear en mear kleurstoffen mei dsDNA, en it fluorescent sinjaal wurdt ek kontinu ferbettere.Nim SYBR Green Ⅰ as foarbyld.
Probe metoade:
Taqman-sonde is de meast brûkte hydrolysesonde.D'r is in fluorescent groep oan 'e 5' ein fan' e sonde, meastal FAM.De sonde sels is in sekwinsje komplemintêr foar it doelgen.D'r is in fluorescent quenching-groep oan it 3′-ein fan 'e fluorofoor.Neffens it prinsipe fan fluorescence resonânsje enerzjy oerdracht (Förster resonânsje enerzjy oerdracht, FRET), doe't de reporter fluorescerende groep (donor fluorescent molekule) en de quenching fluorescent groep (akseptor fluorescent molecule) As de excitation spektrum oerlapet en de ôfstân is hiel ticht (7-10 fluorescerende molekulen fan 'e kin), de akseptor molekule, wylst de autofluorescence wurdt ferswakke.Dêrom, oan it begjin fan 'e PCR-reaksje, as de sonde frij en yntakt is yn it systeem, sil de reporter-fluorescentgroep gjin fluoreszinsje útstjitte.By annealing bine de primer en sonde oan it sjabloan.Tidens it útwreidingsstadium syntetisearret de polymerase kontinu nije keatlingen.DNA-polymerase hat 5′-3′ exonuklease-aktiviteit.By it berikken fan 'e sonde sil de DNA-polymerase de sonde fan' e sjabloan hydrolysearje, de reporter-fluorescentgroep skiede fan 'e quencher-fluorescentgroep en it fluorescent sinjaal loslitte.Om't d'r in ien-op-ien relaasje is tusken de sonde en it sjabloan, is de probemetoade superieur oan 'e kleurstofmetoade yn termen fan 'e krektens en gefoelichheid fan 'e test.

Fig 1 Prinsipe fan qRT-PCR

Primer ûntwerp
Prinsipes:

De primers moatte wurde ûntworpen yn 'e bewarre regio fan' e nukleïnesûrrige en hawwe spesifisiteit.

It is it bêste om cDNA-sekwinsje te brûken, en mRNA-sekwinsje is ek akseptabel.As net, fyn dan it cds-regio-ûntwerp fan 'e DNA-sekwinsje.
De lingte fan it fluorescent kwantitative produkt is 80-150bp, de langste is 300bp, de primerlingte is oer it generaal tusken 17-25 basen, en it ferskil tusken de streamop en streamôfwerts primers moat net te grut wêze.

De G+C-ynhâld is tusken 40% en 60%, en 45-55% is it bêste.
De TM-wearde is tusken 58-62 graden.
Besykje primerdimers en selsdimers te foarkommen, (ferskyne net mear as 4 pearen opfolgjende komplementêre bases) haarspjeldstruktuer, as net te ûntkommen, meitsje ΔG<4.5kJ/mol* As jo ​​net kinne soargje dat gDNA is fuortsmiten tidens omkearde transkripsje Clean, it is it bêste om de primers fan 'e intron te ûntwerpen *3 kin net modifisearre wurde, G′C-regio *3 kin net modifisearre wurde, G′C-regio. /C, A/G trochgeande struktuer (2-3) primers en net-
spesifyk De homology fan de heterogeneously fersterke folchoarder is by foarkar minder as 70% of hat 8 komplementêre basis homology.
Databank:
CottonFGD sykje op trefwurden
Primer ûntwerp:
IDT-qPCR primer ûntwerp

Fig2 IDT online primer design ark side

Fig3 resultaat side werjefte
Untwerp fan lncRNA-primers:
lncRNA:deselde stappen as mRNA.
miRNA:It prinsipe fan 'e stem-loop-metoade: Sûnt alle miRNA's koarte sekwinsjes binne fan sawat 23 nt, kin direkte PCR-deteksje net útfierd wurde, sadat it stem-loop-sekwinsje-ark wurdt brûkt.De stam-loop-sekwinsje is in single-stringed DNA fan sawat 50 nt, dy't sels in haarspjeldstruktuer foarmje kin.3 'It ein kin wurde ûntwurpen as in folchoarder komplemintêr foar de miRNA partiel fragmint, dan kin it doel miRNA wurde ferbûn mei de stem-loop folchoarder by omkearde transkripsje, en de totale lingte kin berikke 70bp, dat is yn oerienstimming mei de lingte fan it fersterke produkt bepaald troch qPCR.Tailing miRNA primer ûntwerp.
Amplifikaasje-spesifike deteksje:
Online blast databank: CottonFGD blast by sequence oerienkomst
Lokale blast: Ferwize nei it brûken fan Blast + om lokale blast te dwaan, linux en Macos kinne direkt in lokale databank fêstigje, win10-systeem kin ek dien wurde nei it ynstallearjen fan ubuntu bash.Meitsje lokale blast databank en lokale blast;iepenje ubuntu bash op win10.
Opmerking: Katoen fan boppelân en katoen op see-eilân binne tetraploïde gewaaksen, dus it resultaat fan blast sil faaks twa of mear wedstriden wêze.Yn it ferline, it brûken fan NAU-cd's as in databank foar it útfieren fan blast is wierskynlik twa homologe genen te finen mei mar in pear SNP-ferskillen.Gewoanlik kinne de twa homologe genen net skieden wurde troch primerûntwerp, sadat se as itselde wurde behannele.As der in dúdlik indel is, wurdt de primer meastentiids op 'e indel ûntwurpen, mar dit kin liede ta de sekundêre struktuer fan' e primer De frije enerzjy wurdt heger, wat liedt ta in fermindering fan amplifikaasje-effisjinsje, mar dit is net te ûntkommen.

Deteksje fan sekundêre primerstruktuer:
Stappen:iepen oligo 7 → ynfier sjabloan folchoarder → slute sub-finster → bewarje → locate primer op sjabloan, druk op ctrl + D te setten primer lingte → analysearje ferskate sekundêre struktueren, lykas sels-dimerization lichem, heterodimer, hairpin, mismatch, ensfh De lêste twa foto yn figuer 4 binne de test resultaten fan de primers.It resultaat fan 'e front primer is goed, der is gjin dúdlik dimer en hairpin struktuer, gjin trochgeande komplementêre bases, en de absolute wearde fan frije enerzjy is minder as 4,5, wylst de efterkant primer toant kontinu De 6 bases binne komplemintêr, en de frije enerzjy is 8,8;dêrneist ferskynt in mear serieuze dimer oan 'e 3' ein, en in dimer fan 4 opienfolgjende bases ferskynt.Hoewol de frije enerzjy net heech is, kin de 3'-dimer Chl de amplifikaasjespesifisiteit en amplifikaasje-effisjinsje serieus beynfloedzje.Dêrnjonken is it nedich om te kontrolearjen op haarspelden, heterodimers en mismatches.

Fig3 oligo7 detection resultaten
Deteksje fan amplifikaasje effisjinsje:
De amplifikaasje-effisjinsje fan 'e PCR-reaksje hat serieus ynfloed op de PCR-resultaten.Ek yn qRT-PCR is de amplifikaasje-effisjinsje benammen wichtich foar de kwantitative resultaten.Fuortsmite oare stoffen, masines en protokollen yn de reaksje buffer.De kwaliteit fan de primers hat ek in grutte ynfloed op de amplification effisjinsje fan qRT-PCR.Om de krektens fan 'e resultaten te garandearjen, moatte sawol de relative fluorescence-kwantifikaasje as de absolute fluorescence-kwantifikaasje de amplifikaasje-effisjinsje fan 'e primers detektearje.It wurdt erkend dat de effektive qRT-PCR-amplifikaasje-effisjinsje tusken 85% en 115% is.D'r binne twa metoaden:
1. Standert kromme metoade:
in.Mix cDNA
b.Gradient dilution
c.qPCR
d.Lineêre regression-fergeliking om de amplifikaasje-effisjinsje te berekkenjen
2. LinRegPCR
LinRegPCR is in programma foar de analyze fan real time RT-PCR Data, ek neamd kwantitative PCR (qPCR) gegevens basearre op SYBR Green of ferlykbere skiekunde.It programma brûkt net-baseline korrizjearre gegevens, fiert in baseline korreksje op eltse stekproef Apart, bepaalt in finster-of-linearity en dan brûkt lineêre regression analyze foar in passe in rjochte line troch de PCR gegevens set.Fanút de helling fan dizze line wurdt de PCR-effisjinsje fan elke yndividuele stekproef berekkene.De gemiddelde PCR-effisjinsje per amplikon en de Ct-wearde per stekproef wurde brûkt om in begjinkonsintraasje per stekproef te berekkenjen, útdrukt yn willekeurige fluorescence-ienheden.Gegevensinput en -útfier binne fia in Excel-spreadsheet.Allinnich foarbyld
mingen is nedich, gjin gradient
stappen binne ferplicht:(Nim Bole CFX96 as foarbyld, net hielendal Masine mei dúdlike ABI)
eksperimint:it is in standert qPCR eksperimint.
qPCR data útfier:LinRegPCR kin werkenne twa foarmen fan útfier triemmen: RDML of kwantifikaasje Amplification resultaat.Yn feite is it de real-time deteksjewearde fan it syklusnûmer en fluorescenssinjaal troch de masine, en de amplifikaasje wurdt krigen troch it analysearjen fan de fluorescensferoaringswearde fan 'e effisjinsje fan' e lineêre segmint.
Data seleksje: Yn teory moat de RDML-wearde brûkber wêze.It wurdt rûsd dat it probleem fan myn kompjûter is dat de software RDML kin net werkenne, dus ik haw de excel-útfierwearde as de orizjinele gegevens.It is oan te rieden om earst in rûge screening fan 'e gegevens út te fieren, lykas it mislearjen fan it tafoegjen fan samples, ensfh. De punten kinne wiske wurde yn' e útfiergegevens (fansels kinne jo se net wiskje, LinRegPCR sil dizze punten yn 'e lettere faze negearje)

Fig5 qPCR gegevens eksportearje

Fig6 seleksje fan kandidaatsamples

Gegevens ynfier:Iepenje kwalifikaasje-amplifikaasjeresultaten.xls, → iepenje LinRegPCR → bestân → lêze út Excel → selektearje parameters lykas werjûn yn figuer 7 → OK → klik bepale baselines

Fig7 stappen fan linRegPCR gegevens ynfier

Resultaat:As der gjin werhelling is, is gjin groepearring nedich.As der werhelling is, kin de groepearring bewurke wurde yn 'e samplegroeping, en de namme fan it gen wurdt ynfierd yn' e identifier, en dan sil itselde gen automatysk groepeare wurde.As lêste, klikje op it bestân, eksportearje excel, en besjoch de resultaten.De amplifikaasje-effisjinsje en R2-resultaten fan elke put sille wurde werjûn.Twads, as jo ferdielen yn groepen, sil de korrizjearre gemiddelde amplifikaasje-effisjinsje wurde werjûn.Soargje derfoar dat de amplifikaasje-effisjinsje fan elke primer tusken 85% en 115% is.As it te grut of te lyts is, betsjut it dat de amplifikaasje-effisjinsje fan 'e primer min is.

Fig 8 Resultaat en gegevens útfier

Eksperiminteel proses:
RNA kwaliteit easken:
Reinheid:1.72.0 jout oan dat der oerbleaun isothiocyanate wêze kin.Clean nucleic acid A260 / A230 moat wêze om 2 .As der in sterke absorption by 230 nm, it jout oan dat der organyske ferbiningen lykas phenate ionen.Derneist kin it wurde ûntdutsen troch 1,5% agarosegelelektroforese.Punt de marker, om't it ssRNA gjin denaturaasje hat en it molekulêre gewicht logaritme gjin lineêre relaasje hat, en it molekulêre gewicht kin net korrekt útdrukt wurde.Konsintraasje: Teoretysknetminder as 100ng / ul, as de konsintraasje te leech is, is de suverens oer it generaal leech net heech

Fig 9 RNA gel

Derneist, as it stekproef kostber is en de RNA-konsintraasje heech is, wurdt it oanrikkemandearre om it nei ekstraksje te aliquotearjen, en it RNA te ferwiderjen nei in definitive konsintraasje fan 100-300ng / ul foar omkearde transkripsje.Ynit proses fan omkearde transkripsje, doe't mRNA wurdt transkribearre, oligo (dt) primers dy't spesifyk kinne bine oan polyA sturten wurde brûkt foar reverse transkripsje, wylst lncRNA en circRNA brûke willekeurige hexamer (Random 6 mer) primers foar reverse transkripsje fan totaal RNA Foar miRNA, miRNA-spesifike nek-loop reverse transkript brûkt wurdt.In protte bedriuwen hawwe no spesjale tailing-kits lansearre.Foar de stem-loop metoade, de tailing metoade is handiger, hege-throughput, en reagent-saving, mar it effekt fan it ûnderskieden miRNAs fan deselde famylje moat net sa goed as de stem-loop metoade.Elke reverse transkripsje kit hat easken foar de konsintraasje fan gen-spesifike primers (stam-loops).De ynterne referinsje brûkt foar miRNA is U6.Yn it proses fan stem-loop inversion, in buis fan U6 moat wurde omkeard apart, en de foar- en efterkant primers fan U6 moatte wurde tafoege direkt.Sawol circRNA as lncRNA kinne HKG's brûke as ynterne referinsje.YncDNA deteksje,
as der gjin probleem is mei RNA, moat cDNA ek goed wêze.As de folsleinens fan it eksperimint lykwols neistribbe wurdt, is it it bêste om in ynterne referinsjegen te brûken (Reference gen, RG) dat gDNA kin ûnderskiede fan cd's.Yn 't algemien is RG in húshâldingsgen., HKG) lykas werjûn yn figuer 10;Op dat stuit makke ik soybean opslachprotein, en brûkte actin7 mei introns as ynterne referinsje.De grutte fan it fersterke fragmint fan dizze primer yn gDNA wie 452bp, en as cDNA waard brûkt as sjabloan, wie it 142bp.Dan de test resultaten fûn dat Part fan de cDNA wie eins fersmoarge troch gDNA, en it bewiisde ek dat der wie gjin probleem mei it resultaat fan reverse transkripsje, en it koe brûkt wurde as sjabloan foar PCR.It is nutteloos in run agarose gel electrophoresis direkt mei cDNA, en it is in diffuse band, dat is net oertsjûgjend.

Fig 10 cDNA-deteksje

De bepaling fan qPCR betingstenis oer it algemien gjin probleem neffens it protokol fan 'e kit, benammen yn' e stap fan tm wearde.As guon primers binne net goed ûntwurpen tidens primer design, resultearret yn in grut ferskil tusken de tm wearde en de teoretyske 60 ° C, is it oan te rieden dat de cDNA Neidat de gebrûk binne mingd, rinne in gradient PCR mei primers, en besykje te foarkommen dat it ynstellen fan de temperatuer sûnder bands as de TM wearde.

Data analyze

De konvinsjonele relative fluorescence kwantitative PCR-ferwurkingsmetoade is yn prinsipe neffens 2-ΔΔCT.Data ferwurkjen template.

Relatearre produkten:

Real Time PCR Easy^TM -Takman

Real Time PCR Easy^TM –SYBR GREEN I

RT Easy I (Master Premix foar synteze fan earste strân cDNA)

RT Easy II (Master Premix foar earste strân cDNA synteze foar qPCR)