Sterilisaasje fan pipettetips en EP-buizen, ensfh.

1. Prepare 0,1% (ien tûzenste) DEPC (heech giftige stof) mei deionized wetter, brûk it foarsichtich yn in dampkap, en bewarje it op 4 ° C fuort fan ljocht;

DEPC wetter is suver wetter behannele mei DEPC en sterilisearre troch hege temperatuer en hege druk.Teste om frij te wêzen fan RNase, DNase en proteinase.

2. Set de pipette tip en EP tube yn 0,1% DEPC, en soargje derfoar dat de pipette tip en EP tube binne fol mei 0,1% DEP.

3. Beskermje fan ljocht, lit stean, oernachtich (12-24h)

4. De doaze mei de tip en EP-buis hoecht net yn DEPC te sûpen.Nei it rûchwei fuortsmiten fan it DEPC-wetter yn 'e tip of EP-buis, pak it op en wikkel it op.

5. 121 graden Celsius, 30min

6. 180 graden Celsius, droech foar ferskate oeren (op syn minst 3 oeren)

Opmerking: a.Draach latekshandschoenen en maskers by it behanneljen fan DEPC!b, of sûnder DEPC sterilisaasje, 130 ℃, 90min autoklaaf (in protte laboratoaria hege temperatuer sterilisaasje twa kear)

RNA ekstraksje oerwagings

Twa wichtige ferskynsels fan weefsel RNA isolaasje mislearring

RNA-degradaasje en resten fan ûnreinheden yn weefsels,oangeande degradaasje, lit ús earst sjen wêrom RNA ekstrahearre út kweekte sellen is net maklik ôfbrutsen.Besteande RNA-ekstraksje-reagenzjes befetsje allegear komponinten dy't RNase rap remme.Foegje de lysate ta oan 'e kweekte sellen, en gewoan mingje it, alle sellen kinne wurde yngeand mingd mei de lysate, en de sellen wurde folslein lysed.Neidat de sellen binne lysed, de aktive yngrediïnten yn 'e lysate fuortendaliks inhibit de intracellular RNase, sadat de RNA bliuwt yntakt.Dat wol sizze, om't de kweekte sellen maklik en folslein yn kontakt komme mei it lysate, wurdt har RNA net maklik ôfbrutsen;oan de oare kant, it RNA yn it weefsel is maklik ôfbrutsen omdat de sellen yn it weefsel binne net maklik om fluch kontakt mei de lysate.troch genôch kontakt.Sa,oannommen dat d'r in manier is om it weefsel yn in inkele sel te feroarjen, wylst RNA-aktiviteit ynhibearret, koe it probleem fan degradaasje folslein oplost wurde.

De meast effektive metoade foar floeistof stikstof milling is.De metoade foar it frezen fan floeibere stikstof is lykwols heul lestich, foaral as it oantal samples grut is.Dit joech oanlieding ta it folgjende bêste ding: de homogenisator.Dehomogenisatormetoade net beskôgje de fraach fan hoe't RNase aktiviteit wurdt inhibited foardat sellen wurde kontakt mei de lysate, mar leaver bidt dat it taryf fan weefsel fersteuring is flugger as de snelheid dêr't intracellular RNase degradearret RN.

It effekt fan elektryske homogenisator is better,en it effekt fan glêshomogenisator is min, mar yn 't algemien kin de homogenisatormetoade it ferskynsel fan degradaasje net foarkomme.Dêrom, as de ekstraksje degradearre is, moat de orizjinele elektryske homogenisator brûkt wurde foar slypjen mei floeibere stikstof;de oarspronklike glêzen homogenisator moat wurde feroare yn in elektryske homogenizer of direkt gemalen mei floeibere stikstof.It probleem is hast 100% mooglik.krije oplost.

It probleem fan ûnreinensresidu dat de folgjende eksperiminten beynfloedet, hat mear ferskate oarsaken dan degradaasje, en de oplossingen binne navenant oars.Ta beslút,as d'r degradaasje of oerbliuwende ûnreinheden yn it weefsel is, moat de ekstraksjemetoade/reagens foar it spesifike eksperimintele materiaal wurde optimalisearre.Jo hoege jo kostbere samples net te brûken foar optimisaasje: jo kinne wat lytse bisten lykas fisk / kip fan 'e merke keapje, it oerienkommende diel fan it materiaal nimme foar RNA-ekstraksje, en it oare diel foar proteïne-ekstraksje - grind mei mûle, mage en darm Extract.

It doel-RNA fan it ekstrahearre RNA wurdt brûkt foar ferskate ferfolcheksperiminten, en de kwaliteitseasken binne oars

cDNA biblioteek konstruksje fereasket RNA yntegriteit sûnder resten fan enzyme reaksje inhibitors;Northern fereasket hegere RNA yntegriteit en legere easken foar enzyme reaksje inhibitors resten;RT-PCR fereasket gjin te hege RNA-yntegriteit,mar inhibits enzyme reaksjes.Residu easken binne strang.De ynfier bepaalt de útfier;elke kear as it doel is om de heechste suverens RNA te krijen, sil it de minsken en jild kostje.

Samling / Opslach fan Samples

Faktoaren dy't degradaasje beynfloedzje Nei't it stekproef it libbene lichem / as de orizjinele groeiomjouwing ferlit, sille de endogene enzymen yn 'e stekproef RNA begjinne te degradearjen,en de ôfbraak taryf is relatearre oan de ynhâld fan endogene enzymen en temperatuer.Tradysjoneel binne d'r mar twa manieren om endogene enzymaktiviteit folslein te remmen: foegje lysate fuortendaliks ta en homogenisearje yngeand en fluch;snij yn lytse stikjes en fuortendaliks frieze yn floeibere stikstof.Beide oanpak fereaskje flugge operaasje.De lêste is geskikt foar alle samples, wylst de eardere allinich geskikt is foar weefsels mei in lege ynhâld fan sellen en endogene enzymen en makliker te homogenisearjen.Spesifyk wurde plantweefsel, lever, thymus, panko's, milt, harsens, fet, spierweefsel, ensfh.

Fragmentaasje en homogenisaasje fan samples

Faktors dy't beynfloedzje degradaasje en opbringst Sample fragmintaasje isfoar yngeande homogenisaasje, dat is foar folsleine en folsleine frijlitting fan RNA.Sellen kinne direkt homogenisearre wurde sûnder brutsen te wurden.Tissues kinne allinich homogenisearre wurde nei't se brutsen binne.Gist en baktearjes moatte wurde brutsen mei oerienkommende enzymen foardat se kinne wurde homogenized.Tissues mei legere endogenous enzyme ynhâld en makliker homogenization kinne wurde ferpletterd en homogenized yn ien kear yn de lysate troch in homogenizer;plantweefsel, lever, thymus, panko's, milt, harsens, fet, spierweefsel en oare samples, Se binne of heech yn endogene enzymen of binne net maklik te homogenisearjen,sa weefsel fersteuring en homogenization moatte wurde útfierd apart.De meast betroubere en meast produktive metoade fan fragmintaasje is milling mei floeibere stikstof, en de meast betroubere metoade fan homogenisaasje is it brûken fan in elektryske homogenisator.In spesjale opmerking oer it frezen mei floeibere stikstof: de stekproef moat net ûntdutsen wurde tidens it hiele frezenproses, om't endogene enzymen earder funksjonearje by beferzen.

Kar fan lysate

It beynfloedzjen fan it gemak fan operaasje en de faktoaren fan oerbliuwende endogene ûnreinheden De meast brûkte lysis-oplossingen kinne de aktiviteit fan RNase hast remme.Dêrom is it kaaipunt fan it kiezen fan in lysis-oplossing te beskôgjen yn kombinaasje mei de suveringsmetoade.Der is ien útsûndering:samples mei hege endogene enzyme-ynhâld wurde oanrikkemandearre om in lysate te brûken dy't fenol befettet om de mooglikheid te fergrutsjen om endogene enzymen te ynaktivearjen.

Keuze fan suvering metoade

Faktoaren dy't de oerbleaune endogene ûnreinheden beynfloedzje, ekstraksjesnelheid Foar skjinne samples lykas sellen kinne befredigjende resultaten wurde krigen mei hast elke suveringsmetoade by de hân.Mar foar in protte oare samples, benammen dy mei hege nivo's fan ûnreinheden lykas planten, lever, baktearjes, ensfh., is it kiezen fan in gaadlike suveringsmetoade krúsjaal.De kolom centrifugal suvering metoade hat in flugge ekstraksje snelheid en kin effektyf fuortsmite ûnreinheden dy't beynfloedzje de folgjende enzymatyske reaksje fan RNA, mar it is djoer (Foregene kin biede kosten-effektive kits, mear details klikhjir);mei help fan ekonomyske en klassike suvering metoaden, lykas LiCl delslach, kin ek krije befredigjend resultaten, mar de operaasje tiid is lang..

"Trije dissiplines en acht oandacht" foar RNA-ekstraksje

Dissipline 1:Meitsje in ein oan de fersmoarging fan eksogene enzymen.

Opmerking 1:Draach strikt maskers en handschoenen.

Opmerking 2:De sintrifuge buizen, tipkoppen, pipetstangen, elektroforesetanks, en eksperimintele banken dy't belutsen binne by it eksperimint moatte goed ôffierd wurde.

Opmerking 3:De reagentia / oplossingen belutsen by it eksperimint, benammen wetter, moatte RNase-frij wêze.

Disipline 2:Blokke de aktiviteit fan endogene enzymen

Opmerking 4:Kies in passende homogenisaasjemetoade.

Opmerking 5:Kies in passend lysate.

Opmerking 6:Kontrolearje it begjinbedrach fan 'e stekproef.

Disipline 3:Ferklearje jo ekstraksjedoel

Opmerking 7:Mei eltse lysate systeem benaderjen liedt ta de maksimale begjinnend bedrach fan sample, sakket de winning súkses taryf skerp.

Opmerking 8:It ienige ekonomyske kritearium foar suksesfolle RNA-ekstraksje is in súkses yn folgjende eksperiminten, net opbringst.

Top 10 boarnen fan RNase-fersmoarging

1. Fingers binne de earste boarne fan eksogene enzymen, dus wanten moatte wurde droegen en ferfongen faak.Dêrneist moatte ek maskers droegen wurde, om't sykheljen ek in wichtige boarne fan enzymen is.In ekstra foardiel fan it dragen fan in handschoenmasker is om de eksperimintator te beskermjen.

2. Pipette tips, centrifuge buizen, pipetten - RNase kin net ynaktivearre wurde troch sterilisaasje allinnich, sa pipette tips en centrifuge buizen moatte wurde behannele mei DEPC, sels as se wurde markearre as DEPC behannele.It is it bêste om in spesjale pipette te brûken, foar gebrûk mei in 75% alkohol katoenen bal, benammen de roede;wês der ek wis fan dat jo gjin holle remover brûke.

3. It wetter / buffer moat wêze frij fan RNase fersmoarging.

4. Op syn minst de test tafel moat wurde skjinmakke mei 75% alkohol katoen ballen.

5.Endogene RNase Alle weefsels befetsje endogene enzymen, dus fluch befriezen fan weefsels mei floeibere stikstof is de bêste manier om degradaasje te ferminderjen.De metoade foar opslach / slypjen fan floeibere stikstof is yndie ûngemaklik, mar it is de ienige manier foar weefsels mei hege nivo's fan endogene enzymen.

6. RNA-monsters RNA-ekstraksjeprodukten kinne spoaren fan RNase-fersmoarging befetsje.

7. Plasmid-ekstraksje Plasmid-ekstraksje brûkt faaks RNAse om RNA te degradearjen, en de oerbleaune RNAse moat wurde ferwurke mei Proteinase K en ekstrahearre troch PCI.

8. RNA opslach Sels as it wurdt opslein by lege temperatuer, spoar bedraggen fan RNase sil feroarsaakje RNA degradaasje.De bêste oplossing foar lange-termyn behâld fan RNA is in sâlt / alkohol suspensie, omdat alkohol inhibits alle enzymatyske aktiviteit by lege temperatueren.

9. As kationen (Ca, Mg) dizze ioanen befetsje, sil it ferwaarmjen op 80C foar 5 minuten feroarsaakje dat RNA knipt wurdt, dus as RNA ferwaarme moat, moat de behâldoplossing in chelaatmiddel befetsje (1mM Sodium Citrate, pH 6.4).

10. Enzymen dy't brûkt wurde yn folgjende eksperiminten kinne kontaminearre wurde troch RNase.

10 Tips foar RNA-ekstraksje

1: Fluch RNase-aktiviteit foarkomme.Samples wurde gau beferzen nei kolleksje, en RNase wurdt ynaktivearre troch flugge operaasje tidens lysis.

2: Kies in passende ekstraksjemetoade foar weefsel mei hege ribozym-ynhâld, en adiposeweefsel is it bêste om de metoade te brûken dy't fenol befettet.

3: Prediction kwaliteit fereasket Northern, cDNA biblioteek konstruksje fereasket hege yntegriteit, en RT-PCR en RPA (Ribonuclease beskerming assay) net nedich hege yntegriteit.RT-PCR fereasket hege suverens (enzyme-inhibitorresiduen).

4: Grutte homogenisaasje is de kaai foar it ferbetterjen fan opbringst en it ferminderjen fan degradaasje.

5: Kontrolearje de yntegriteit fan RNA-elektroforese-deteksje, 28S: 18S = 2: 1 is in folslein teken, 1: 1 is ek akseptabel foar de measte eksperiminten.

6: Fuortsmite fan DNA foar RT-PCR, array analyze It is it bêste om Dnase I te brûken om DNA te ferwiderjen.

7: Ferminderje de fersmoarging fan eksogene enzymen - enzymen kinne net fan bûten ymportearre wurde.

8: By it konsintrearjen fan nukleïnsûr mei lege konsintraasje moat in ko-precipitaasje-reagens tafoege wurde.Mar om te foarkommen dat de co-precipitant enzymen en DNA-fersmoarging befettet.

9: It RNA goed oplosse, as it nedich is, waarmje op 65C foar 5 minuten.

geskikt opslach metoade

It kin wurde opslein by -20C foar in koarte tiid, en by -80C foar in lange tiid.De earste stap yn it ferbetterjen fan RNA-opbringsten is om te realisearjen dat de RNA-ynhâld fan ferskate samples sterk ferskilt.Hege oerfloed (2-4ug/mg) lykas lever, panko's, hert, medium oerfloed (0.05-2ug/mg) lykas harsens, embryo, nieren, long, thymus, eierstok, lege oerfloed (<0.05ug/mg) mg) lykas blaas, bonke, fet.

1: Lyse-sellen om RN frij te meitsjen - as RNA net wurdt frijlitten, sil de opbringst wurde fermindere.Elektryske homogenisaasje wurket better dan oare homogenisaasjemetoaden, mar moat miskien ek kombineare wurde mei oare metoaden, lykas floeibere stikstofmashing, enzymatyske spiisfertarring (Lysozyme/Lyticase)

2: Optimalisaasje fan de ekstraksjemetoade.De grutste problemen mei phenol-basearre metoaden binne ûnfolsleine stratifikaasje en in part RNA-ferlies (de supernatant kin net folslein fuortsmiten wurde).Ûnfolsleine stratification komt troch hege nucleic soer en aaiwyt ynhâld, dat kin wurde oplost troch it fergrutsjen fan it bedrach fan lysate brûkt of ferminderjen it bedrach fan sample.In stap fan chloroform ekstraksje waard tafoege oan it adipose weefsel.RNA-ferlies kin wurde fermindere troch werom-pompen of troch it fuortheljen fan de organyske laach folge troch sintrifugering.It grutste probleem mei kolom centrifugation-basearre metoaden is oerstallige sample.

Classic Extraction Tips

1. Phenol suvering: Foegje in lykweardich folume fan 1: 1 Phenol / Chloroform en mingje krêftich foar 1-2 minuten.Centrifugerje op hege snelheid foar 2 minuten.Ferwiderje de supernatant foarsichtich (80-90%).Kom noait nei de middelste laach.In lykweardich folume fan de reaksje oplossing kin tafoege wurde oan Phenol / Chloroform en de supernatant fuortsmiten.De twa supernatanten kinne mei-inoar mingd wurde foar ôfslach fan nukleïnesûr om de opbringst te ferbetterjen.Wês net te sêft by it mingjen, en besykje net alle supernatant te ferwiderjen.

2. Waskje mei 70-80% ethanol: By it wassen moat it nukleïnesûr ophongen wurde om te soargjen dat it oerbliuwende sâlt fuortwosken wurdt.Tagelyk, fuortendaliks nei it útgieten fan de ethanol, centrifuge op hege snelheid foar in pear sekonden, en dan fuortsmite de oerbleaune ethanol mei in pipet.Oplosse nei it stean by keamertemperatuer foar 5-10 minuten.

11. Ekstraksje fan spesjale organisaasjes

1. Fibrous weefsel: De kaai foar RNA-ekstraksje út fibrous weefsel lykas hert / skeletal spieren is om folslein fersteure it weefsel.Dizze weefsels hawwe lege sel tichtens, sadat it bedrach fan RNA per ienheid gewicht fan weefsel is leech, en it is it bêste om te brûken safolle mooglik startbedrach.Wês wis dat it weefsel yngeand grind wurdt ûnder befrieze betingsten.

2. Tissues mei hege protein / fet ynhâld: harsens / plantaardige fet ynhâld is heech.Nei PCI-ekstraksje befettet de supernatant wite floccules.De supernatant moat opnij ekstrahearre wurde mei chloroform.

3. Tissues mei hege nucleic acid / ribozym ynhâld: de milt / thymus hat hege nucleic acid en ribozym ynhâld.Slijpen fan weefsel ûnder beferzen omstannichheden folge troch rappe homogenisaasje kin ribozymes effektyf ynaktivearje.As it lysate lykwols te viskeus is (fanwege hege ynhâld fan nukleïnesûre), sil de PCI-ekstraksje net effektyf stratifisearje kinne;tafoegjen fan mear lysate kin oplosse dit probleem.Meardere PCI-ekstraksjes kinne mear oerbliuwende DNA ferwiderje.As der fuort nei it tafoegjen fan alkohol in wyt delslach ûntstiet, jout dat oan op DNA-fersmoarging.Re-ekstraksje mei soere PCI nei ûntbining kin DNA-fersmoarging fuortsmite.

4. Plant weefsel: Plant weefsel is komplekser as dier weefsel.Yn 't algemien wurde planten grûn ûnder floeibere stikstofbetingsten, sadat RNA-degradaasje troch endogene enzymen ûngewoan is.As it degradaasjeprobleem net wurdt oplost, wurdt it hast wis feroarsake troch ûnreinheden yn 'e stekproef.De ûnreinheden befette yn in protte planten sille liede ta resten, en de reden foar resten is faak omdat dizze ûnreinheden hawwe wat oerienkomsten mei RNA: do precipitate en ik precipitate, en do adsorb en ik adsorb.Dizze skaaimerken bepale dat se tige sterke enzyme-ynhibitoren binne.

Op it stuit kinne kommersjele RNA-ekstraksje-reagenzjes mei lytse oanpassingen oanpast wurde oan hast alle dierlike weefsels, mar d'r binne in pear kommersjele RNA-ekstraksje-reagenzjes dy't geskikt kinne wêze foar de measte plantweefsels.Gelokkich, Foregene kin foarsjen spesjaleplant RNA ekstraksje kits, wy hawwePlant Total RNA Isolaasje kit, Plant Total RNA Isolation kit Plus.Dy lêste is spesjaal ûntwurpen foar planten mei hege polysaccharide en polyphenol ynhâld.Foar RNA-ekstraksje is feedback fan lab-brûkers benammen goed.

12. It effekt fan sample freezing en thawing De beferzen stekproef kin grutter wêze, en it moat besunige wurde foardat se brûkt wurde foar RNA-ekstraksje.Samples tend to smelten (mooglik foar in part) by cutting.Beferzen samples moatte miskien wurde woegen foardat RNA-ekstraksje, en ûntdooijen sil definityf foarkomme tidens dit proses.Soms komt it ûntdooijen fan it stekproef ek foar tidens it proses fan it frezen fan floeibere stikstof;of de beferzen stekproef wurdt direkt tafoege oan de lysate sûnder floeibere stikstof milling, en thawing sil definityf foarkomme foar de folsleine homogenization.Eksperiminten hawwe oantoand dat beferzen weefsel mear gefoelich is foar RNA-degradaasje by it ûntjaan dan farsk weefsel.De wierskynlike reden: It freeze-thaw-proses fersteurt struktueren binnen de sel, wêrtroch it makliker is foar endogene enzymen om yn direkt kontakt te kommen mei it RNA.

13. Oardiel fan RNA-kwaliteit Meastentiids wurdt elektroforese brûkt om de yntegriteit fan RNA te beoardieljen, en A260 / A280 wurdt brûkt om de suverens fan RNA te beoardieljen.Yn teory hat yntakt RNA in ferhâlding fan 28S:18S = 2.7:1, en de measte gegevens beklamje de ferhâlding fan 28S:18S = 2:1.It feit is dat hast gjin fan 'e RNA ekstrahearre út oare samples as sellen is yn in 2: 1-ferhâlding (dit waard krigen mei de Agilent Bioanalyzer).

De electrophoresis resultaten fan RNA wurde beynfloede troch in protte faktoaren, ynklusyf sekundêre struktuer, electrophoresis betingsten, sample load, graad fan sêding troch EB, ensfh Brûk native electrophoresis foar in detect RNA en brûk DNA Marker as in kontrôle.As de 28S by 2kb en de 18S by 0.9kb dúdlik binne, en 28S: 18S> 1, kin de yntegriteit foldwaan oan de easken fan de measte folgjende eksperiminten.

A260 / A280 is in yndikator dy't in protte betizing feroarsake hat.Earst fan alles, is it nedich om te ferdúdlikjen de oarspronklike betsjutting fan dizze yndikator foar nucleic soeren: suver RNA, syn A260/280 = likernôch 2,0.Pure RNA is de 'oarsaak' en A260/A280 = 2 is it 'effekt'.No brûkt elkenien A260 / A280 as 'oarsaak', tinkend dat "as A260 / A280 = 2, dan is RNA suver", wat natuerlik liedt ta betizing.

As jo ​​​​ynteressearre binne, kinne jo in lyts reagens tafoegje dat faaks wurdt brûkt yn ekstraksje, lykas fenol, guanidine isothiocyanate, PEG, ensfh., Oan jo RNA-monster, en mjit dan de A260/A280-ferhâlding.De realiteit is dat in protte fan 'e reagentia brûkt foar RNA-ekstraksje, lykas ek in protte ûnreinheden yn' e stekproef, sawat A260 en A280 absorbearje, wat A260 / A280 beynfloedet.

De meast ynstruktive oanpak op it stuit is om RNA-samples te scannen yn it berik fan 200-300 nm.De kromme fan suver RNA hat de folgjende skaaimerken: de kromme is glêd, A230 en A260 binne twa bûgingspunten, A300 is tichtby 0, A260/A280 = om 2.0, en A260/A230 = om 2.0.As scangegevens net beskikber binne, moat de A260/A230-ferhâlding ek bepaald wurde, om't dizze ferhâlding gefoeliger is foar oerdracht fan alle ûnreinheden dy't de enzymatyske reaksje beynfloedzje.Nim rekken mei it lineêre berik fan it apparaat (0,1-0,5 foar A260).

Der binne twa oare nuttige ferskynsels: de ferhâlding sil sa'n 0,3 leger wêze as A260/A280 yn wetter mjitten wurdt;wylst de ferhâlding mjitten yn 10 mM EDTA is oer 0,2 heger as dat mjitten yn 1 mM EDTA.

Relatearre produkten:

China Plant Total RNA Isolation Kit Fabrikant en leveransier |Foregene (foreivd.com)

RNA isolaasje rige Suppliers en Factory |Sina RNA-isolaasje-searje fabrikanten (foreivd.com)

RNA isolaasje rige - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)