Wy binne betûfte fabrikant.Winning fan de mearderheid yn 'e krúsjale sertifikaasjes fan har merk foar grutte koarting China High Sensitivity One-Step Probe Rt-QpcrKit V2, Kwaliteit is it libben fan it fabryk, Fokus op 'e fraach fan klanten is de boarne fan bedriuwslibben en ûntwikkeling, Wy hâlde oan earlikens en goed fertrouwen wurkhâlding, sjogge út nei jo komst!
Wy binne betûfte fabrikant.Wining de mearderheid yn 'e krúsjale sertifikaten fan syn merk foarChina Taq DNA Polymerase, Qpcr, Us bedriuw belooft: ridlike prizen, koarte produksjetiid en befredigjende tsjinst nei ferkeap, wy wolkom jo ek om ús fabryk te besykjen op elk momint dat jo wolle.Winskje no dat wy tegearre in noflike en lange termyn bedriuw hawwe!!!

Beskriuwings

Dizze kit brûkt in unyk lysisbuffersysteem dat RNA fluch kin frijlitte út kweekte selmonsters foar RT-qPCR-reaksjes, en elimineert dêrmei it tiidslinende en moeisame RNA-suveringsproses.It RNA-sjabloan kin yn mar 7 minuten wurde krigen.De 5×Direct RT Mix en 2×Direct qPCR Mix-SYBR reagents levere troch de kit kinne fluch en effektyf real-time kwantitative PCR-resultaten krije.

5 × Direkte RT Mix en 2 × Direkte qPCR Mix-SYBR hawwe sterke inhibitor tolerânsje, en de lysate fan de gebrûk kin brûkt wurde as it sjabloan foar RT-qPCR direkt.Dit kit befettet de unike RNA hege affiniteit Foregene reverse transkriptase, en Hot D-Taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl₂, reaksje buffer, PCR optimizer en stabilisator.

Spesifikaasjes

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Kit komponinten

Funksjes & foardielen

■ Ienfâldich en effektyf: mei Cell Direct RT-technology kinne RNA-monsters yn mar 7 minuten wurde krigen.

■ De fraach nei stekproef is lyts, sa leech as 10 sellen kinne wurde hifke.

■ Hege trochstreaming: it kin fluch detect RNA yn sellen kweekte yn 384, 96, 24, 12, 6-well platen.

■ DNA Eraser kin fluch fuortsmite frijjûn genomen, sterk ferminderjen de ynfloed op folgjende eksperimintele resultaten.

■ Optimalisearre RT- en qPCR-systeem makket de twa-stap RT-PCR omkearde transkripsje effisjinter en PCR mear spesifyk, en mear resistint foar RT-qPCR-reaksje-ynhibitoren.

Kit applikaasje

Tapassingsgebiet: kweekte sellen.

- RNA útbrocht troch monster lysis: allinnich fan tapassing op de RT-qPCR sjabloan fan dizze kit.

- De kit kin brûkt wurde foar de folgjende doelen: analyse fan gen-ekspresje, ferifikaasje fan siRNA-bemiddeld gen-silencing-effekt, drugsscreening, ensfh.

Diagram

Opslach en Shelf libben

Diel I fan dizze kit moat wurde opslein by 4 ℃;Diel II moat wurde opslein by -20 ℃.

Foregene Protease Plus II moat wurde opslein by 4 ℃, net befrieze by -20 ℃.

Reagent 2×Direct qPCR Mix-SYBR moat wurde opslein by -20 ℃ yn it tsjuster;as it faak brûkt wurdt, kin it ek wurde opslein by 4 ℃ foar koarte termyn opslach (brûke binnen 10 dagen). Wy binne erfarne fabrikant.Winning de mearderheid yn 'e krusjale sertifikaten fan har merk foar Grutte koarting China High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, Kwaliteit is it fabryk' libben , Fokus op klant 'fraach is de boarne fan bedriuw oerlibjen en ûntwikkeling, Wy hâlde oan earlikens en goed fertrouwen wurkjende hâlding, sjogge út nei jo komst!
Grutte koartingChina Taq DNA Polymerase, Qpcr, Us bedriuw belooft: ridlike prizen, koarte produksjetiid en befredigjende tsjinst nei ferkeap, wy wolkom jo ek om ús fabryk te besykjen op elk momint dat jo wolle.Winskje no dat wy tegearre in noflike en lange termyn bedriuw hawwe!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Cat.No.DRT-01021/01022

Foar sel direkte RT-qPCR mei ≤ 1000.000 sellen

Produkt yntroduksje

Dit produkt brûkt in unyk lysisbuffersysteem om RNA fluch frij te meitsjen fan kweekte selmonsters foar RT-qPCR-reaksjes, it eliminearjen fan it tiidslinende en moeisame RNA-suveringsproses, en mar 7 minuten om it fereaske RNA-sjabloan te krijen, mei de 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman levere troch de kit kin fluch en effisjint realtime resultaten krije fan PCR.

5× Direct RT Mix en 2× Direct qPCR Mix-Taqman hawwe sterke inhibitor tolerânsje en kin útfiere effisjinte omkearing en spesifike amplification mei help fan it lysate fan de stekproef te mjitten as sjabloan.It reagens befettet Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer en Stabilisator, dy't brûkt wurde mei lysisbuffer om samples fluch en maklik te ûntdekken, en hat de skaaimerken fan hege gefoelichheid, spesifisiteit en stabiliteit.

Produkteigenskippen

Ienfâldige, effektive Cell Direct RT-technology dy't sa min as 7 minuten duorret om RNA-monsters te krijen.

Sample easken binne lyts, en in minimum fan 10 kweekte sellen kinne brûkt wurde foar eksperimintearjen.

Hege trochstreaming foar rappe RNA-akwisysje fan kweekte sellen lykas 384, 96, 24, 12, en 6-well platen.

DNA Eraser is by steat om fluch fuortsmite frijjûn genomen, sterk ferminderjen fan de ynfloed op folgjende eksperimintele resultaten.

Optimalisearre RT- en qPCR-systemen meitsje twa-stap RT-PCR mooglik mei effisjinter omkearde transkripsje, spesifisiteit, en sterkere RT-qPCR-reaksje-inhibitortolerânsje.

Kit applikaasje

Tapassingsgebiet: Cultured sellen.

Sample lysis ynterpretearre RNA: brûkt allinnich as twa-stap RT-qPCR template.

Kits kinne brûkt wurde foar de folgjende doelen: analyse fan genregulearjende ekspresje, allele-testen, drugsscreening, ensfh.

Kit beheinings

Amplified fragminten ≤ 300 bp.

Kits wurde brûkt om sellen frisse te kultivearjen.

Produkt kwaliteit kontrôle

Neffens it FOREGENE's Total Quality Management System, wurdt elke batch fan Cell Direct RT-qPCR-searjekits meardere kearen strang hifke om de betrouberens en stabiliteit fan 'e kwaliteit fan elke batch kits te garandearjen.

Kit ynhâld

*:Cell Lysis, 5 × Direct RT Mix, 2 × Direct qPCR Mix-Taqman kin apart wurde kocht, details wurde jûn yn taheakke 1 (PAGE 13).

Opslach betingsten

1. Shipping Betingsten

It hiele proses fan ferfier fan lege temperatuer iispakketten, om te soargjen dat de kit yn 'e <4 °C steat is.

2. Opslach betingsten

Bewarje diel I op 4 ° C en diel II op -20 ° C.

De Foregene Protease Plus II moat wurde opslein by 4 ° C, net beferzen by -20 ° C.

Reagent 2 × Direct qPCR Mix-Taqman wurdt opslein by -20 ° C, of ​​by 4 ° C foar koarte termyn gebrûk as faak brûkt (binnen 10 dagen).

Kit komponint ynformaasje

Buffer CL: Biedt de omjouwing dy't nedich is foar sellysisreaksjes.

Buffer ST: Beëiniget de aktive stof yn 'e lysate om effekten op folgjende RT te foarkommen.

DNA Eraser: DNA-ferwidering, it effekt fan it fuortheljen fan it genom op folgjende eksperiminten.

5 × Direct RT Mix: Befettet hege RNA-affiniteit Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTP's, stabilisators, enhancers, optimizers, en reverse transcription primers foar optimale ôfstimming (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: Yn 'e kontekst fan lysisbuffer wurde sellen lysearre om nukleïnesoeren frij te meitsjen.

2 × Direct qPCR Mix-Taqman: Dit reagens befettet Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTP's, MgCl₂, reaksje buffer, PCR optimizer, en stabilisator.

20× ROX Reference Dye: Algemien brûkt op Real Time PCR-amplifikaasjeynstruminten fan ABI, Stratagene en oare bedriuwen, wurdt it brûkt om it ferskil oan te passen tusken PCR-buizen en buizen feroarsake troch PCR-doseringsflaters.De 20 × ROX Reference Dye-konsintraasje nedich foar ferskate ynstruminten is oars, en de brûker kin it tafoegje neffens de oanrikkemandearre konsintraasje fan it ynstrumint.

RNase-frije ddH₂O: RNase-frij sterilisearre ultra suver wetter foar twa-stap RT-qPCR reaksjes.

Foarsoarchsmaatregels:(Wês wis dat jo de foarsoarchsmaatregels sekuer lêze foardat jo de kit brûke)

Soarch omtinken foar de operaasjemetoade fan it eksperimint om krúskontaminaasje tusken samples te foarkommen.

Soarch omtinken foar de skjinens fan 'e eksperimintele omjouwing en gebrûksfoarwerpen om RNase-fersmoarging en RNA-degradaasje te foarkommen.

Nim farske of goed bewarre selmonsters en brûke nea werhelle befrieze-ûndjippe selmonsters.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman moat werhelle freeze-thaw foarkomme, oars sil it omkearde transkripsje en PCR-effisjinsje beynfloedzje.

Preparantsoenenfoaroperaasje

Wês wis dat jo de ynstruksjes sekuer lêze foardat jo dizze kit brûke.De Cell Direct RT-qPCR Kit is ienfâldich, handich en rap te betsjinjen, en de ynstruksjes jouwe folsleine ynformaasje oer de heule kit en hoe't jo it korrekt brûke.Tariede asjebleaft de nedige eksperimintele materialen en apparatuer foar gebrûk.

Eksperimintele materialen en apparatuer

◆ Kultuer sellen.

◆ 1,5 ml of 2 ml, RNase-/DNase-Free centrifuge tube, RNase-/DNase-Free tip, 0,2 ml sterile qPCR-buis.

◆ qPCR-masine, pipet, tabletop-sintrifuge (≥13.400×g) (ôfhinklik fan eksperimintele behoeften), ensfh.

Feilichheid

◆ Dit produkt is allinich foar wittenskiplike ûndersyksdoelen, brûk it asjebleaft net foar farmaseutyske, klinyske, iten en kosmetyske doelen.

◆ Draach by it brûken fan gemikaliën passende labklean, wanten, beskermjende bril, ensfh.

Operaasjegidsen

Cell Lysis systemen, RT systemen, en qPCR reaksje oplossing supplement packs kinne wurde kocht apart, foar details yn taheakke 1 (PAGE 13).

Operaasje gids

A: Sample RNA release

1.Sellen waarden foarbehannele: Waskje de selkultuerplaat mei kâld PBS, dan lysearje de sellen (10-10)⁶), 10⁶ as it bedrach fan sellen, wurdt oanrikkemandearre Foregene de sel in RNA Isolation Kit de Totaal (DE-03111) of Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) foar RNA ekstraksje en suvering.

1.1.Adherent sellen (24-well plaat as foarbyld)

1.1.1.Bepale it oantal sellen yn elke put, bepale dat it oantal sellen 1 × 10 is⁵, en brûk in pipet om it kultuermedium út it kultuerskûtel te ferwiderjen.

1.1.2.Foegje 200 μl fan pre-gekoelde 1 × PBS ta oan elke boarne.Pipetteer net kearen en ferwiderje PBS út 'e putten.Tilt de plaat en fuortsmite safolle PBS mooglik.Trochgean nei stap 2.

1.1.3.Ferskillende sel kultuer skûtel as in referinsje nûmer tabel 1-1 yn in sel kultuer skûtel waard tafoege precooled 1 × PBS foar sel waskjen.

Tabel 1-1: PBS-dosering foar ferskate oantallen sellen

Noat:Om te soargjen foar in stevige adherent sellen,in grut oantal selferlies foarkommen by it waskjen.

1.2.Suspension sellen as oanhingjende sellen kultivearre yn net-poreuze platen

1.2.1.Adherent sellen yn kultuer brocht yn net-multi well platen (suspension sellen begjinne út de folgjende stap 1.2.2), sammelje en skieden de sellen neffens de normale sel kolleksje metoade, en pleats se yn in kultuer plaat of centrifuge buis;as trypsinization wurdt brûkt, easkje centrifugation te sammeljen de sellen en te ferwiderjen oerbleaune trypsin, tafoege PBS resuspended sellen yn yndividuele sellen te fersprieden de sellen.

1.2.2.Nei it oantal sellen teld, aliquoted sellen 1 × 10⁵ ien om buizen te sintrifugeren, sellen sammelje troch sintrifugering by 1000 × g foar 10 min.

1.2.3.Foegje 200 μl PBS ta oan 'e sintrifugebuis, pipet net werhelle, en aspirearje de PBS direkt.gean troch nei stap 2. (As dreech te precipitate en de sellen waarden resuspended wer, meie wurde útfierd 1000 × g centrifuged 10 min nei ôffieren fan de supernatant, de sel pellet gean nei stap 2)

2.Cell lysis: Fuortsmite Buffer CL, syn temperatuer lykwicht oan keamertemperatuer, DNA Eraser en Foregene Protease Plus II, neffens de folgjende tabel 1-2 taret lysis systeem: (Lysis oplossing is klear foar gebrûk).

Tabel 1-2: cleavage systeem tarieding (Opmerking: yn 'e tarieding op iis)

3.(24-well plaat as in foarbyld) Pipetteer 200 μl fan sel lysis master mix yn elke put, Herhalend blaze 5-10 kear, Incubate by keamertemperatuer (20-25 ℃) foar 5 min.

Noat:Om foar te kommen dat de foarming fan bubbels, please doe't pipetting pipette skaal waard oanpast oan 200μl of minder.De sellen kinne nei lysis bewolkt ferskine, wat normaal is.

4.(24 -well plaat as in foarbyld) wurdt tafoege yn de floeistof 20 μl Buffer ST (ferskillende lysis systemen Buffer ST tafoege yn in bedrach werjûn yn Tabel 1-3), werhelle pipetting 5-10 kear, by keamertemperatuer (20-25 ℃) waarden incubated foar 2 min.

Noat:De pipet tip ôfset ûnder it oerflak, soargje derfoar dat de lysate waard tafoege,om de foarming fan bubbels te foarkommen, asjebleaft as de pipetteerpipetskaal waard oanpast oan 200μl of minder.

Tabel 1-3:Add Buffer ST

5.De lysate wurdt brûkt foar folgjende RT-qPCR eksperiminten.As de folgjende eksperiminten net op 'e tiid kinne wurde útfierd, hâld it dan asjebleaft op iis foar net mear dan 2 oeren, en bewarje op -20 ℃ of -80 ℃ (net mear as trije moannen).

B: RT systeem tarieding

1.Take out 5 × Direct RT Mix en pleats it op in iis bad, lit it smelten natuere, en sêft mix it foar letter gebrûk;nim RNase-Free ddH2O út en smelt it en pleats it op in iisbad foar letter gebrûk.Bereid it reaksjesysteem op iis neffens tabel 2-1 hjirûnder.

Tabel 2-1: Tarieding fan RT reaksje systeem

2.After foltôging fan systeem formulearring, sêft mingd en centrifuged koart yn de folgjende tabel 2 -2 reaksje betingsten RT reaksje.

Tabel 2-2: RT Reaction condition ynstelling

3.Nei it foltôgjen fan 'e reaksje waard it reaksjeprodukt direkt op iis pleatst foar qPCR, asjebleaft de lange termyn behâld -20 ℃ of -80 ℃.

Opmerking: Troch it gebrûk fan net-suvere sjabloan, kinne wite delslach ferskine yn it omkearde transkripsjeprodukt.Dit is in normaal ferskynsel.Centrifugerje de supernatant fuortendaliks foar folgjende eksperiminten.

De resultearjende RT reaksje oplossing wurdt tafoege oan de folgjende Step Real Time PCR reaksje systemen, it wurdt oanrikkemandearre om te foegjen bedraggen fariearjend fan 10-30% fan de reaksje systeem.

C: qPCR reaksje systeem tarieding

1.Appropriate bedrach fan B taret yn stap cDNA sjabloan neffens de folgjende tabel 3-1 te rieden in reaksje systeem.

Opmerking: It bedrach fan cDNA-sjabloan makket 10-30% fan it qPCR-systeem út.Bygelyks, yn in 20μl qPCR-systeem, add 2-6 μl lysisbuffer, mar net mear as 6 μl.

2.De optimalisaasje goede qPCR betingsten (Annealing temperatuer, etc.) foar qPCR reaksje (De reaksje betingsten jûn by Tabel 3-2).

Opmerking: besykje optimalisearre betingsten te brûken foar qPCR-reaksjes om bettere resultaten te krijen.

Tabel 3-1: Tarieding fan PCR reaksje systeem

1 *: Primer konsintraasje kin oanpast wurde yn it berik fan 50-900 nM as primer reaksje prestaasjes is min.

Opmerking: It qPCR-systeem kin oanpast wurde neffens eksperimintele behoeften en fluorescinsje-cyclermodel.Foar qPCR yn in 50μl systeem, oanpasse de reagensdosearring evenredich neffens de 20μl systeem.

2 *: Selektearje de passende definitive konsintraasje fan ROX Reference Dye neffens de fluorescence kwantitative termyske cycler.De meast geskikte ROX Reference Dye-konsintraasjes foar gewoane fluorescinsje kwantitative fytsers wurde werjûn yn 'e tabel hjirûnder:

Tabel 3-2: qPCR reaksje betingsten wurde foarsjoen

Opmerking: Om it bêste qPCR-effekt te krijen, kin gradient PCR brûkt wurde om de reaksjebetingsten te optimalisearjen foar ferskate sjabloanen en ferskate primers.PCR reaksje betingsten fariearje ôfhinklik fan de fluorescence analysator, template, primer, ensfh Yn de spesifike operaasje, de optimale reaksje betingsten moatte wurde ûntwurpen neffens de spesifike betingsten fan de fluorescence kwantitative termyske cycler, template type, grutte fan it fragmint fan belang, basis folchoarder fan de fersterke fragmint en GC ynhâld en lingte fan primers, ynklusyf reaksje tiid, ensfh.

Real Time PCR primer ûntwerpprinsipes

Foarút Primer en Reverse Primer

Foar Real Time PCR is primerûntwerp heul wichtich.Primers binne relatearre oan de spesifisiteit en effisjinsje fan PCR-amplifikaasje, en kinne wurde ûntwurpen mei ferwizing nei de folgjende prinsipes:

◆ Primer lingte: 18-30bp.

◆ GC ynhâld: 40-60%.

◆ Tm-wearde: Primer-ûntwerpsoftware, lykas Primer 5, kin de Tm-wearde fan 'e primer jaan.De Tm-wearden fan 'e streamop- en streamôfwerts primers moatte sa ticht mooglik wêze.De Tm-berekkeningsformule kin ek brûkt wurde: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).By it útfieren fan PCR wurdt in temperatuer ûnder de primer Tm-wearde fan 5 ° C algemien selektearre as de annealingtemperatuer (de oerienkommende ferheging fan 'e annealingtemperatuer kin de spesifisiteit fan 'e PCR-reaksje ferheegje).

◆ Primers en PCR-produkten:

◆ Design primer PCR amplification produkt lingte is by foarkar 100-150bp.

◆ Untwerpprimers yn it sekundêre strukturele gebiet fan 'e sjabloan moatte safolle mooglik foarkommen wurde.

◆ Foarkom de formaasje fan 2 of mear komplementêre basen tusken de 3 'einen fan streamop en streamôfwerts primers.

◆ Primer 3′ terminalbasis kin net oanwêzich wêze mei 3 ekstra opfolgjende G of C.

◆ De primers sels kinne gjin komplementêre struktueren hawwe, oars sil in haarspjeldstruktuer foarme wurde, dy't ynfloed hat op PCR-amplifikaasje.

◆ ATCG moat wurde ferdield sa evenredich mooglik yn 'e primer folchoarder, en de 3' terminal basis moat wurde mijd as T.

Taheakke1:Cell direktRT-qPCR Kit komponintt oanfolling pakket

1.Cell Lysis Solution