It is bekend dat yn it sintrale dogma RNA de transkripsjonele mediator is tusken DNA en proteïne-ekspresje.Yn ferliking mei de detectie fan DNA kin de detectie fan RNA de genekspresje yn organismen objektyfer reflektearje.Eksperiminten wêrby't RNA befetsje: qRT-PCR, RNA-Seq, en fúzje gen detection, ensfh Op grûn fan de skaaimerken fan RNA sels (de sûker ring fan RNA hat ien mear frije hydroxyl groep as de sugar ring fan DNA), keppele oan in grut oantal RNases yn it miljeu, RNA is mear ynstabyl en makliker te wurde ôfbrutsen as DNA.Garbage yn, garbage out, as de kwaliteit fan RNA net goed is, dan moatte de eksperimintele resultaten ûnfoldwaande wêze, spesifyk manifestearre as ûnkrekte gegevens of minne werhelling.Dêrom moat mear omtinken wurde betelle oan 'e ferwurking fan RNA, en de keppeling fan kwaliteitskontrôle is ek wichtiger om de krektens en krektens fan folgjende eksperimintele gegevens te garandearjen.

Foar de kwaliteitskontrôle fan RNA binne d'r oer it algemien de folgjende meast brûkte metoaden:

• Spektrofotometry
• agarose gel elektroforese
• Agilent Bioanalyzer
• real-time fluorescent kwantitative PCR
• Qubit fluorescent kleurstof metoade

01 Spektrofotometry

RNA hat konjugearre dûbele obligaasjes en hat in absorption peak op in golflingte fan 260nm.Neffens de wet fan Lambert-Beer kinne wy ​​de RNA-konsintraasje berekkenje fan 'e absorption pyk by 260nm.Derneist kinne wy ​​​​ek de suverens fan RNA berekkenje neffens de ferhâlding fan 260nm, 280nm en 230nm absorption peaks.280nm en 230nm binne respektivelik de opnamepieken fan aaiwiten en lytse molekulen.De ferhâlding fan A260 / A280 en A260 / A230 fan kwalifisearre RNA suverens moat wêze grutter as 2. As it is minder as 2, it betsjut dat der aaiwyt of lytse molekulen fersmoarging yn de RNA sample en moat wurde suvere wer.Boarnen fan kontaminaasje sille ynfloed hawwe op streamôfwerts eksperiminten, lykas it remmen fan de amplifikaasje-effisjinsje fan PCR-reaksjes, wat resulteart yn ûnkrekte kwantitative resultaten.De suverens fan RNA hat in grutte ynfloed op folgjende resultaten, dus spektrofotometry is oer it algemien in ûnmisbere keppeling foar kwaliteitskontrôle yn 'e earste stap yn eksperiminten mei nukleïnesûr.

figuer 1. Typysk RNA / DNA Absorption Spectrum

02 Agarose gel elektroforese

Neist suverens is de yntegriteit fan RNA ek ien fan 'e wichtige yndikatoaren foar it beoardieljen fan de kwaliteit fan RNA.De degradaasje fan RNA sil liede ta in grut oantal koarte fragminten yn 'e stekproef, sadat it oantal RNA-fragminten dy't effektyf kinne wurde ûntdutsen en bedutsen troch de referinsjesekwinsje sil wurde fermindere.RNA-yntegriteit kin wurde kontrolearre troch elektroforese fan totale RNA op in 1% agarosegel.Dizze metoade kin de gel sels konfigurearje, of brûk it prefabrikeare E-Gel™-systeem foar yntegriteitstests.Mear dan 80% fan it totale RNA is ribosomaal RNA, wêrfan de mearderheid bestiet út 28S en 18S rRNA (yn sûchdiersystemen).RNA fan goede kwaliteit sil twa foar de hân lizzende ljochte balken sjen litte, dy't respektivelik 28S en 18S ljochte balken binne op 5 Kb en 2 Kb, en de ferhâlding sil oanstriid om tichtby 2: 1 te wêzen.As it yn in diffuse steat is, betsjuttet it dat it RNA-monster kin wurde degradearre, en it wurdt oanrikkemandearre om de letter beskreaune metoade te brûken om de kwaliteit fan RNA fierder te testen.

Figuer 2. Fergeliking fan ôfbrutsen (baan 2) en yntakt RNA (baan 3) op agarosegelelektroforese

03 Agilent Bioanalyzer

Neist de hjirboppe beskreaune metoade foar elektroforese fan agarosegel, dy't ús kin helpe om de yntegriteit fan RNA ienfâldich en fluch te identifisearjen, kinne wy ​​ek de Agilent bioanalyzer brûke om de yntegriteit fan RNA te bepalen.It brûkt in kombinaasje fan mikrofluidika, kapillêre elektroforese, en fluoreszinsje om RNA-konsintraasje en yntegriteit te beoardieljen.Troch it ynboude algoritme te brûken om it profyl fan it RNA-monster te analysearjen, kin de Agilent bioanalyzer in referinsjewearde fan RNA-yntegriteit, RNA-yntegriteitnûmer (hjirnei oantsjutten as RIN) [1] berekkenje.Hoe grutter de wearde fan RIN, hoe heger de yntegriteit fan it RNA (1 is ekstreem degradearre, 10 is de meast folsleine).Guon eksperiminten mei RNA suggerearje it brûken fan RIN as parameter foar kwaliteitsbeoardieling.As foarbyld, de rjochtlinen fan Oncomine ™ Human Immune Repertoire, dat wurdt brûkt om B-sel- en T-sel-antigenreceptors yn Thermo Fisher's Oncomine-paniel-searje te detektearjen, suggerearje dat samples mei RIN-wearden grutter dan 4, Effektiver lêzen en clones kinne wurde mjitten en klonen.D'r binne ferskate oanrikkemandearre berik foar ferskate panielen, en faaks kin in hegere RIN effektiver gegevens bringe.

Ofbylding 3, yn Oncomine ™ Human Immune Repertoire-eksperiminten, kinne samples mei RIN grutter dan 4 effektiver lêzen en T-selklonen detectearje.【2】

De RIN-wearde hat lykwols ek wat beheiningen.Hoewol RIN hat in hege korrelaasje mei de kwaliteit fan NGS eksperimintele gegevens, it is net geskikt foar FFPE samples.FFPE-monsters binne in lange tiid gemysk behannele, en it ekstrahearre RNA hat oer it algemien in relatyf lege RIN-wearde.Dit betsjut lykwols net dat de effektive gegevens fan it eksperimint ûnfoldwaande moatte wêze.Om de kwaliteit fan FFPE-monsters sekuer te beoardieljen, moatte wy oare mjittingen brûke dan RIN.Neist RIN kin Agilent bioanalyzer ek DV200-wearde berekkenje as in evaluaasjeparameter fan RNA-kwaliteit.DV200 is in parameter dy't it oanpart fan fragminten grutter as 200 bp yn in RNA-monster berekkent.DV200 is in bettere yndikator fan FFPE sample kwaliteit as RIN.Foar it RNA ekstrahearre troch FFPE hat it in heul hege korrelaasje mei it oantal genen dat effektyf kin wurde ûntdutsen en it ferskaat oan genen [3].Hoewol DV200 de tekoarten yn 'e kwaliteitsdeteksje fan FFPE kin goedmeitsje, kin de Agilent bioanalyzer noch altyd de kwaliteitsproblemen yn RNA-samples net wiidweidich analysearje, ynklusyf oft d'r ynhibitoren binne yn 'e samples.Inhibitoren sels kinne ynfloed op de amplifikaasje-effisjinsje fan streamôfwerts eksperiminten en ferminderje it bedrach fan brûkbere gegevens.Om te witten oft d'r in ynhibitor yn 'e stekproef is, kinne wy ​​​​de neiste beskreaune fluorescent kwantitative PCR-metoade oannimme.

04 real-time fluorescent kwantitative PCR

De real-time fluorescent kwantitative PCR-metoade kin net allinich de ynhibitoren yn 'e stekproef detektearje, mar ek de kwaliteit fan RNA yn' e FFPE-monster krekt reflektearje.Yn ferliking mei Agilent biologyske analysatoren, real-time fluorescence kwantitative ynstruminten binne populêrder yn grutte biologyske laboratoaria fanwege harren bredere tapassing.Om de kwaliteit fan RNA-monsters te testen, moatte wy allinich primerprobes keapje of tariede foar ynterne referinsjegenen, lykas GUSB (Cat nr. Hs00939627).Troch dizze set fan primers, probes en noarmen (totaal RNA fan bekende konsintraasje) te brûken om absolute kwantitative eksperiminten út te fieren, kin de effektive konsintraasje fan RNA-fragminten wurde berekkene as de evaluaasjestandert fan RNA-kwaliteit (Funksjonele RNA-kwantitaasje (FRQ) koart).Yn in NGS-test fûnen wy dat de FRQ fan RNA-samples in heul hege korrelaasje hat mei it effektive datavolumint.Foar alle samples grutter dan 0.2ng / uL FRQ, op syn minst 70% fan 'e lêzen kin effektyf dekke de referinsje folchoarder (figuer 4).

Figuer 4, de FRQ wearde ûntdutsen troch de fluorescence kwantitative metoade hat in tige hege korrelaasje (R2> 0.9) mei de effektive gegevens krigen yn it NGS eksperimint.De reade line is de FRQ-wearde lyk oan 0.2 ng/uL (log10 = -0.7).【4】

Neist it fan tapassing op FFPE-samples, kin de real-time kwantitative PCR-metoade ek effektyf ynhibitoren yn samples kontrolearje.Wy kinne it te ûntdekken stekproef tafoegje yn it reaksjesysteem mei ynterne positive kontrôle (IPC) en har assay, en dan fluoreszenskwantifikaasje útfiere om de Ct-wearde te krijen.As de Ct-wearde efter de Ct-wearde bliuwt yn 'e reaksje sûnder sample, jout it oan dat de ynhibitor yn' e stekproef oanwêzich is en de amplifikaasje-effisjinsje yn 'e reaksje ynhibeart.

05 Qubit fluorescent kleurstof metoade

Qubit Fluorometer is it meast brûkte lytse apparaat foar konsintraasje fan nukleïnesûr en suverensdeteksje, dat maklik te betsjinjen is en bestiet yn hast alle molekulêre biologylaboratoaren.It berekkent de konsintraasje fan nukleïnesûr sekuer troch detectie en nukleïnesûr-binende fluorescent kleurstof (Qubit-deteksjereagens).Qubit hat hege gefoelichheid en spesifisiteit, en kin RNA sekuer kwantifisearje oant pg / µL konsintraasje.Neist it bekende fermogen om de konsintraasje fan nukleïnesûr sekuer te kwantifisearjen, kin it lêste nije model fan Thermo Fisher, Qubit 4.0, ek de yntegriteit fan RNA detektearje.Qubit 4.0's RNA-deteksjesysteem (RNA IQ Assay) detektearret de yntegriteit fan RNA troch tagelyk twa spesifike fluorescent kleurstoffen te detektearjen.Dizze twa fluorescent kleurstoffen kinne respektivelik bine oan grutte fragminten en lytse fragminten fan RNA.Dizze twa fluorescent kleurstoffen jouwe it oanpart fan grutte fragminten fan RNA yn 'e stekproef oan, en dêrút kin de IQ-wearde (yntegriteit en kwaliteit) dy't de RNA-kwaliteit fertsjintwurdiget, wurde berekkene.De IQ-wearde is fan tapassing op sawol FFPE- as net-FFPE-samples, en hat in grutte ynfloed op 'e folgjende sequencing-kwaliteit.Troch NGS-eksperiminten as foarbyld te nimmen, yn 'e RNA-Seq-testeksperiminten útfierd op it Ion torrent™-platfoarm, hienen de measte samples mei IQ-wearden grutter dan 4 op syn minst 50% effektive lêzen (figuer 5).Yn ferliking mei de hjirboppe neamde deteksjemetoaden is Qubit IQ Assay net allinich handiger om te operearjen en nimt minder tiid (binnen fiif minuten), mar hat ek in geweldige korrelaasje tusken de mjitten parameter IQ-wearde en de gegevenskwaliteit fan streamôfwerts eksperiminten.

Figuer 5, d'r is in geweldige korrelaasje tusken de Qubit RNA IQ-wearde en de yn kaart brochte lêzingen fan RNA-Seq.【5】

Troch de boppesteande ynlieding leau ik dat elkenien in foldwaande begryp hat fan ferskate metoaden foar RNA-kwaliteitskontrôle.Yn 'e praktyk kinne jo kiezede oerienkommende metoade neffens it stekproeftype en besteande ynstruminten.Allinich troch de kwaliteit fan RNA goed te kontrolearjen kinne wy ​​it mislearjen fan folgjende eksperiminten foarkomme troch minne samplekwaliteit, sadat kostbere tiid, enerzjy en kosten besparje.

Referinsjeprodukten:

Animal Totaal RNA Isolaasje Kit

Sel Totaal RNA Isolaasje Kit

referinsjes

【1】 Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S., et al.De RIN: in RNA-yntegriteitsnûmer foar it tawizen fan yntegriteitswearden oan RNA-mjittingen.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】 Oncomine Human Immune Repertoire User Guide (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】 Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Derived From Archival Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Sciences, Volume 3 – 70e, August 3, 70e.https://doi.org/10.1093/toxsci/