1. Inisjele begryp
Op dit stadium moatte wy wat begripen en terminology begripe, om foar te kommen dat flaters meitsje foar ús senioaren, lykas:
F: Wat is it ferskil tusken RT-PCR, qPCR, Real-time PCR, en real-time RT-PCR?
Antwurd: RT-PCR is omkearde transkripsje PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR), dat is in wiid brûkte fariant fan polymerase chain reaction (PCR).Yn RT-PCR wurdt in RNA-string omkeard transkribearre yn komplementêr DNA, dat dan wurdt brûkt as sjabloan foar DNA-amplifikaasje troch PCR.
Real-time-PCR en qPCR(Kwantitative Real-ltime-PCR) binne itselde ding, beide binne real-time kwantitative PCR, dat betsjut dat elke syklus fan PCR hat real-time gegevens records, sadat it oantal begjinnende sjabloanen kin oanpast wurde presys analyze.
Hoewol't sawol Real-time PCR (real-time fluorescent kwantitative PCR) as Reverse transcription PCR (reverse transcription PCR) lykje ôfkoarte te wurden as RT-PCR, is de ynternasjonale konvinsje: RT-PCR ferwiist spesifyk nei reverse transcriptionPCR, Real-time PCR wurdt algemien ôfkoarte as qPCR (kwantitative real-time PCR).
En real-time RT-PCR (RT-qPCR), It is de omkearde transkripsje PCR kombinearre mei de fluorescent kwantitative technology: krije earst cDNA (RT) fan RNA reverse transkripsje, en brûk dan Real-time PCR foar kwantitative analyze (qPCR).De measte laboratoaria dogge RT-qPCR, dat is, ûndersyk nei RNA-ekspresje-down-regulaasje, sadat de qPCR dêr't elkenien it oer hat yn it laboratoarium eins ferwiist nei RT-qPCR, mar ferjit net dat der noch in protte DNA-tests binne yn klinyske tapassingen.Kwantitative analyze, lykas hepatitis B-firus HBV-deteksje.
Fraach: Nei it lêzen fan in protte fluorescent kwantitative PCR, wêrom moat it fersterke fragmint wurde kontrolearre binnen it berik fan 80-300bp?
Antwurd: De lingte fan elke gensekwinsje is oars, guon binne ferskate kb, guon binne hûnderten bp, mar wy hoege allinich de produktlingte te fereaskje om 80-300bp te wêzen by it ûntwerpen fan primers, te koart of te lang binne net geskikt foar fluorescent kwantitative PCR-deteksje.It produktfragmint is te koart om te ûnderskieden fan 'e primer-dimer.De lingte fan 'e primer-dimer is sawat 30-40bp, en it is dreech om te ûnderskieden oft it in primer-dimer is as in produkt as it minder is as 80bp.As it produktfragmint te lang is, mear as 300bp, sil it maklik liede ta lege amplifikaasje-effisjinsje en kin it bedrach fan it gen net effektyf detektearje.
As jo bygelyks telle hoefolle minsken yn in klaslokaal sitte, hoege jo allinich te tellen hoefolle mûlen der binne.Itselde is wier as jo ûntdekke genen, jo moatte allinne detect in bepaalde folchoarder fan in gen te fertsjintwurdigjen De hiele folchoarder sil dwaan.As jo minsken telle wolle, moatte jo beide mûlen en noas, earen en glêzen telle, en it is maklik om flaters te meitsjen.
Om út te wreidzjen, yn biologysk ûndersyk, binne d'r in protte ûndersyksgefallen fan punt nei gebiet, om't de gensekwinsje fan elke soart heul lang is, it is net nedich en ûnmooglik om alle fragminten te mjitten, lykas baktearjele 16S-sekwinsje, dat is om de konservative folchoarder fan baktearjes út te fieren Assays om it oantal fan in bepaalde populaasje fan baktearjes ôf te lieden.
F: Wat is de optimale lingte foar qPCR-primerûntwerp?
Antwurd: Yn 't algemien is de primerlingte sawat 20-24bp, wat better is.Fansels moatte wy omtinken jaan oan de TM-wearde fan 'e primer by it ûntwerpen fan' e primer, om't dit ferbân hâldt mei de optimale annealingtemperatuer.Nei in protte eksperiminten is bewiisd dat 60°C in bettere TM-wearde is.As de annealing temperatuer is te leech, it sil maklik liede ta net-spesifike amplification.As de annealing temperatuer is te heech, de amplification effisjinsje sil wêze relatyf leech, de peak fan de amplification kromme sil begjinne letter, en de CT wearde wurdt fertrage.
F: Hoe is de kleurstofmetoade oars fan 'e probemetoade?
Antwurd: Dye metoadeGuon fluorescent kleurstoffen, lykas SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, ensfh, emit gjin ljocht troch harsels, mar sil emit fluorescence neidat bining oan de lytse groove fan dûbele-stringed DNA.Dêrom, oan it begjin fan 'e PCR-reaksje, kin de masine it fluorescent sinjaal net detektearje.As de reaksje it poadium fan annealing-útwreiding berikt, wurdt de dûbele strân iepene, en in nije strân wurdt synthesisearre ûnder de aksje fan DNA-polymerase, en it fluorescent molekule bynt oan 'e dsDNA-lytse groove.As it oantal PCR-syklusen tanimt, wurde mear en mear kleurstoffen kombineare mei dûbelstrenged DNA, en it fluorescent sinjaal wurdt ek kontinu ferbettere.De kleurstofmetoade wurdt benammen brûkt yn wittenskiplik ûndersyk.
PS: Wês foarsichtich by it dwaan fan it eksperimint, de kleurstof moat kombineare wurde mei minsklik DNA, wês foarsichtich om it yn in fluorescent persoan te feroarjen.
Dye metoade (links) Probe metoade (rjochts)
PS: Wês foarsichtich by it dwaan fan it eksperimint, de kleurstof moat kombineare wurde mei minsklik DNA, wês foarsichtich om it yn in fluorescent persoan te feroarjen.
SYBR Grien Ⅰ bindet oan de lytse groove fan DNA
Probe metoadeTaqman-sonde is de meast brûkte hydrolysesonde.D'r is in fluorescent groep oan 'e 5'-ein fan' e sonde, meastentiids FAM, en de sonde sels is in sekwinsje komplemintêr foar it doelgen.D'r is in fluorescent quenching-groep oan 'e 3'-ein.Neffens it prinsipe fan fluorescence resonânsje enerzjy oerdracht (Förster resonânsje enerzjy oerdracht, FRET), doe't de reporter fluorescent groep (donor fluorescent molecule) en de quenching fluorescent groep (akseptor fluorescent molecule) wurde opwekke As de spektra oerlaapje en de ôfstân is hiel tichtby (7-10 de excitation fan de fluorescerende kin), de akseptor molekule, wylst de autofluorescence wurdt ferswakke.Dêrom, oan it begjin fan 'e PCR-reaksje, as de sonde frij en yntakt is yn it systeem, sil de reporter-fluorescentgroep gjin fluoreszinsje útstjitte.By annealing bine de primer en sonde oan it sjabloan.Tidens it útwreidingsstadium syntetisearret de polymerase kontinu nije keatlingen.DNA-polymerase hat 5′-3′ exonuklease-aktiviteit.By it berikken fan 'e sonde sil de DNA-polymerase de sonde fan' e sjabloan hydrolysearje, de reporter-fluorescentgroep skiede fan 'e quencher-fluorescentgroep en it fluorescent sinjaal loslitte.Om't d'r in ien-op-ien relaasje is tusken de sonde en it sjabloan, is de probemetoade superieur oan 'e kleurstofmetoade yn termen fan 'e krektens en gefoelichheid fan 'e test.De probemetoade wurdt benammen brûkt yn diagnoaze.
F: Wat is absolute kwantifikaasje?Wat is relative kwantifikaasje?
Antwurd: Absolute kwantifikaasje ferwiist nei de berekkening fan it earste kopynûmer fan 'e stekproef te testen troch qPCR, lykas hoefolle HBV-firussen binne yn 1ml bloed.It resultaat krigen troch relative kwantifikaasje is de feroaring yn 'e hoemannichte fan it doelgen yn in spesifike stekproef relatyf oan in oare referinsjemonster, en de geneekspresje is op- of omleechregulearre.
F: Sil de hoemannichte RNA-ekstraksje, effisjinsje fan reverse transkripsje, en effisjinsje fan amplifikaasje ynfloed hawwe op de eksperimintele resultaten?
F: Sil sample opslach, ekstraksje reagents, reverse transcription reagents, en ljocht-transmitting verbruiksartikelen beynfloedzje de eksperimintele resultaten?
F: Hokker metoade kin de eksperimintele gegevens korrigearje?
Oangeande dizze problemen sille wy se yn detail beskriuwe yn 'e avansearre en avansearre seksjes hjirûnder.
2. Avansearre kennis
Wat real-time fluorescent kwantitative PCR oanbelanget, moatte wy de realiteit erkenne dat tûzenen wittenskiplike ûndersykspapieren elk jier wurde publisearre, wêrby't de fluorescent kwantitative PCR-technology net in lyts oantal is.
As d'r gjin mienskiplike standert is om it fluorescent kwantitative PCR-eksperimint te mjitten, kinne de resultaten breed ferskille.Foar itselde gen fan deselde soarte, mei deselde ferwurkingsmetoade, sille de deteksjeresultaten ek breed ferskille, en it sil lestich wêze foar letkomers om deselde resultaten te werheljen.Jo Nimmen wit wat goed is en wat ferkeard is.
Betsjut dit dat fluorescent kwantitative PCR in cheattechnology is as in ûnbetroubere technology?Nee, it is om't fluorescent kwantitative PCR gefoeliger en krekter is, en in bytsje ferkearde operaasje sil folslein tsjinoerstelde resultaten produsearje.In lyts ferlies is tûzen kilometer fuort.De skriuwer fan it artikel kin werhelle wurde martele troch de resinsinten.Tagelyk binne de resinsinten fan it tydskrift ek lestich te kiezen út ferskate eksperimintele resultaten.
Al mei al, wiist op in gebrek oan konsensus yn real-time PCR-eksperiminten.Foar dit doel begûnen senior wittenskippers yn 'e yndustry noarmen te formulearjen,easkjen fan bydragen om wat needsaaklike eksperimintele en gegevensferwurkingsdetails (ynklusyf nedige gegevens) yn it artikel te leverjen om oan dizze noarmen te foldwaan.
Resinsinten kinne de kwaliteit fan it eksperimint beoardielje troch dizze details te lêzen;takomstige lêzers kinne dit ek brûke om it eksperimint te werheljen of it eksperimint te ferbetterjen.Dan binne de op dizze manier krigen eksperimintele resultaten fol mei ynformaasje, hege kwaliteit en brûkber.
MIBBI (Minimum ynformaasje foar biologyske en biomedyske ûndersiken -http://www.mibbi.org) ûntstien.MIBBI is in projekt dat noarmen foar eksperiminten leveret.It wurdt publisearre yn de natuer.Dit projekt is rjochte op ferskate biologyske eksperiminten, ynklusyf sel biology, Microarray, qPCR wy sille beprate no, ensfh, en soarget foar elk type eksperimint by it yntsjinjen fan manuskripten.Dy ynformaasje moat altyd wurde levere.
Yn it MIBBI-projekt binne d'r twa artikels yn ferbân mei fluorescent kwantitative PCR, nammentlik:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) - in strukturearre taal- en rapportaazjegids foar real-time kwantitative PCR-gegevens;
·MIQE (Minimum ynformaasje foar publikaasje fan kwantitative real-time PCR-eksperiminten) - minimale ynformaasje foar it publisearjen fan artikels oer real-time kwantitative PCR-eksperiminten.
Litte wy earst prate oer RDML, de terminologyspesifikaasje.
As der foar alles gjin standertdefinysje is, is it ûnmooglik om de diskusje troch te gean, en dêrom is de útlis fan termen sa wichtich yn it eksamen.
De terminology brûkt yn it fluorescent kwantitative PCR-eksperimint omfettet de folgjende ynhâld.QIAGEN hat de bêste gearfetting foar ús makke.De folgjende binne allegear droechguod .
Amplification kromme
De amplifikaasjekromme ferwiist nei de kromme makke tidens it PCR-proses, mei it syklusnûmer as de abscissa en de real-time fluoreszinsje-yntensiteit tidens de reaksje as de ordinaat.
In poerbêste amplifikaasjekromme moat de folgjende skaaimerken hawwe: de basisline is flak of in bytsje fermindere, en der is gjin dúdlike opkommende trend;it bûgingspunt fan 'e kromme is dúdlik, en de helling fan' e eksponinsjele faze is evenredich mei de amplifikaasje-effisjinsje.Hoe grutter de helling, hoe heger de amplifikaasje-effisjinsje;de algemiene amplification curve It parallelisme is goed, wat oanjout dat de amplification-effisjinsje fan elke buis ferlykber is;de eksponinsjele faze fan de amplification kromme fan lege-konsintraasje samples is fanselssprekkend.
Basisline (Basisline)
De basisline is it lûdsnivo fan 'e iere syklus, meastentiids mjitten tusken de 3e en 15e syklus, omdat de fluorescence wearde ferheging feroarsake troch it amplification produkt kin net ûntdutsen yn dizze perioade.It oantal syklusen dat brûkt wurdt om de basisline te berekkenjen kin farieare wurde en moatte miskien wurde fermindere as hege sjabloanbedragen wurde brûkt of as it ekspresjenivo fan it doelgen heech is.
It ynstellen fan de basisline fereasket it besjen fan fluoreszinsjegegevens fan 'e lineariteit-amplifikaasjekromme.De basisline is sa ynsteld dat de groei fan 'e amplifikaasjekromme begjint mei in syklusnûmer grutter as it topnûmer fan' e baseline-syklus.Basislinen moatte yndividueel ynsteld wurde foar elke doelsekwinsje.De gemiddelde fluoreszinsjewearden ûntdutsen yn 'e iere syklusen moatte wurde subtrahearre fan' e fluoreszinsjewearden krigen yn 'e amplified produkten.De lêste ferzjes fan ferskate Real-Time PCR software tastean automatyske optimalisaasje fan baseline ynstellings foar yndividuele samples.
Tidens de earste pear syklusen fan 'e PCR-amplifikaasjereaksje feroaret it fluoreszenssinjaal net folle.It benaderjen fan in rjochte line wurdt de basisline neamd, mar as wy de earste pear syklusen goed sjogge, sjogge wy dat binnen de basisline wat bart yn 'e ôfbylding hjirûnder.
Eftergrûn Eftergrûn ferwiist nei
de net-spesifike fluoreszinsjewearde yn 'e reaksje.Bygelyks: net effisjinte fluorescence quenching;of in grut oantal dûbele strâne DNA sjabloanen troch it brûken fan SYBR Green.De eftergrûnkomponinten fan it sinjaal wurde wiskundich fuortsmiten troch it Real-Time PCR-softwarealgoritme.
Ferslachjouwer sinjaal
Reporter sinjaal ferwiist nei it fluorescent sinjaal oanmakke troch SYBR Green of fluorescently markearre sequence-spesifike probes tidens Real-Time PCR.
Normalized Reporter Signal (RN)
RN ferwiist nei de fluorescinsje-yntensiteit fan 'e reporterferve dield troch de fluorescinsje-yntensiteit fan' e passive referinsjeferve mjitten by elke syklus.
Passive Reference Dye
Yn guon Real-Time PCR's,de fluorescent kleurstof ROX wurdt brûkt as in ynterne ferwizing te normalisearjen it fluorescent sinjaal.It korrizjeart foar fariaasjes fanwege ûnkrekt pipetting, putposysje en fluoreszensfluktuaasjes op in goed-by-well basis.
De fluorescensdrompel (drompel)
waard oanpast boppe de eftergrûnwearde en signifikant ûnder de plateauwearde fan 'e amplifikaasjekromme.It moat lizze yn 'e lineêre regio fan' e amplifikaasjekromme, dy't it log-lineêre berik fan PCR-deteksje fertsjintwurdiget.Drompels moatte wurde ynsteld yn de log-amplification curve werjefte sadat de log-lineêre faze fan PCR is maklik identifisearje.As d'r meardere doelgenen binne yn Real-Time PCR, moat de drompel foar elk doel ynsteld wurde.Yn 't algemien wurdt it fluoreszinsjesinjaal fan' e earste 15 syklusen fan PCR-reaksje brûkt as it fluoreszinsje-eftergrûnsinjaal, en de fluoreszinsje-drompel is 10 kear de standertdeviaasje fan it fluoreszinsjesinjaal fan 'e earste 3 oant 15 PCR-syklusen, en de fluoreszensdrompel is ynsteld yn 'e eksponinsjele faze fan PCR.Yn 't algemien hat elk ynstrumint syn fluoreszensdrompel ynsteld foar gebrûk.
Cycle Threshold (CT) of Crossing Point (CP)
De syklus wêrby't de amplifikaasjekromme de drompel trochkrúst (dat wol sizze, it punt wêrop fluoreszensdeteksje signifikant tanimme).CT kin in fraksje en it bedrach fan startmal kin wurde berekkene.De CT-wearde stiet foar it oantal syklusen dat wurdt belibbe as it fluorescent sinjaal yn elke PCR-reaksjebuis de ynstelde drompel berikt.D'r is in lineêre relaasje tusken de CT-wearde fan elke sjabloan en de logaritme fan it earste kopynûmer fan it sjabloan, deheger it earste kopynûmer, hoe lytser de CT-wearde, en oarsom.In standert kromme kin makke wurde troch it brûken fan in standert mei bekend initial kopy getal, wêrby't de abscissa stiet foar de CT wearde, en de ordinate stiet foar de logaritme fan de earste kopy nûmer.Sa lang as de CT-wearde fan 'e ûnbekende stekproef wurdt krigen, kin it earste kopynûmer fan' e stekproef wurde berekkene út 'e standertkurve.
ΔCT wearde
ΔCT wearde beskriuwtit ferskil tusken it doelgen en de oerienkommende endogene referinsjegen CT-wearde, lykas in húshâldgen, en wurdt brûkt om de hoemannichte brûkte sjabloan te normalisearjen:
⇒ΔCT = CT (doelgen) - CT (endogenous reference gen)
ΔΔCT Wearde
De ΔΔCT-wearde beskriuwt it ferskil tusken de gemiddelde ΔΔCT-wearde fan in stekproef fan belang (bgl. stimulearre sellen) en de gemiddelde ΔΔCT-wearde fan in referinsjemonster (bgl. unstimulearre sellen).It referinsjemonster wurdt ek wol it kalibraasjeprobe neamd en alle oare samples wurde dêrop normalisearre foar relative kwantifikaasje:
⇒ΔΔCT = gemiddelde ΔCT (sample of interest) - gemiddelde ΔCT (referinsjemonster)
Endogene referinsjegenen (endogene referinsjegenen)
De ekspresjenivo's fan endogene referinsjegenen, lykas housekeeping-genen (housekeeping-genen), ferskille net tusken samples.It fergelykjen fan de CT-wearden fan it referinsjegen mei it doelgen makket it mooglik om it ekspresjenivo fan it doelgen te normalisearjen nei it bedrach fan ynfier-RNA of cDNA (sjoch de seksje oer ΔCT-wearden hjirboppe).
Ynterne ferwizing genen korrekt foarmooglike RNA-degradaasje of de oanwêzigens fan enzyme-ynhibitoren yn RNA-samples, lykas fariaasjes yn RNA-ynhâld, effisjinsje fan reverse transkripsje, herstel fan nukleïnesoeren en sample-ôfhanneling.Om de optimale referinsjegen (en) te selektearjen, hawwe wy it algoritme oanpast om syn seleksje fan 'e optimale referinsje ôfhinklik fan 'e eksperimintele ynstelling mooglik te meitsjen.
Ynterne kontrôle
In kontrôlesekwinsje dy't wurdt fersterke yn deselde reaksje as de doelsekwinsje en probearre mei in oare probe (dat wol sizze, duplex PCR útfiere).Ynterne kontrôles wurde faak brûkt om mislearre amplifikaasjes út te sluten, lykas wannear't de doelsekwinsje net ûntdutsen wurdt.
Kalibraasje Sample
In referinsjemonster (bygelyks suvere RNA fan in selline of weefsel) brûkt yn relative kwantifikaasje om alle oare samples te fergelykjen om it relative ekspresjenivo fan in gen te bepalen.De kalibraasjemonster kin elke stekproef wêze, mar is normaal in kontrôle (bygelyks in net behannele stekproef of in stekproef út tiid nul fan it eksperimint).
Positive kontrôles
brûke kontrôle reaksjes meibekende bedraggen fan template.Positive kontrôles wurde faak brûkt om te kontrolearjen dat in primer-set of primer-probe-set goed wurket en dat de reaksje goed is ynsteld.
Gjin sjabloankontrôle (NTC)
In kontrôle reaksje dy't befettet alle nedige komponinten fan de amplification reaksje útsein it sjabloan, dat wurdt meastal ferfongen troch wetter.It gebrûk fan NTC kin de fersmoarging fine dy't feroarsake is troch reagensfersmoarging as bûtenlânske DNA, en garandearret dus de autentisiteit en betrouberens fan 'e deteksjegegevens.Amplifikaasje fan 'e NTC-kontrôle jout fersmoarging oan.
Gjin RT-kontrôle (NRT)
RNA-ekstraksjeproses kin oerbliuwend genomysk DNA befetsje, dat ekstreem skealik is en de skuldige is dy't de gegevenskwaliteit beynfloedet en de natuerlike fijân fan qPCR, dus by it ûntwerpen fan eksperiminten moat it wurde ûntwurpen om allinich RNA-deteksje te fersterkjen.D'r binne twa manieren, ien is om primers oer introns te ûntwerpen, de oare is om DNA folslein te ferwiderjen, hokker is better, dy't letter sil wurde besprutsen.De NTR-kontrôle is in magyske spegel om DNA-fersmoarging te detektearjen.As der fersterking is, betsjut dat dat der fersmoarging is.
Standerts
Noarmen binne samples fan bekende konsintraasje as kopynûmer dy't wurde brûkt om in standertkromme te konstruearjen.Om de stabiliteit fan 'e standert te garandearjen, wurdt it genfragmint meastentiids yn it plasmide klone en as standert brûkt.
De standert kromme
wurdt meastal verdund yn op syn minst 5 konsintraasje gradients mei de standert produkt neffens de ferdûbeling ferhâlding, en 5 punten wurde lutsen yn de koördinaten fan CT wearde en kopy getal, en de punten wurde ferbûn te foarmjen in line foar it generearjen fan in standert kromme.Foar elke standertkromme moat de jildigens wurde kontrolearre.De hellingswearde falt tusken -3.3 en -3.8, en elke konsintraasje wurdt útfierd yn triplicate.Punten dy't signifikant ferskille fan oare punten moatte wurde wegere.De CT-wearde fan it te testen stekproef wurdt yn 'e standertkromme brocht, en it ekspresjenivo fan 'e te testen stekproef kin wurde berekkene.
De CT-wearde fan it te testen stekproef wurdt yn 'e standertkromme brocht, en it earste kopynûmer fan 'e te testen stekproef kin wurde berekkene.
Effisjinsje en Slope
De helling fan 'e standert kromme fertsjintwurdiget de effisjinsje fan real-time PCR.
· In helling fan -3.322 jout oan dat de PCR-amplifikaasje-effisjinsje 1 is, of 100% effisjint, en de hoemannichte PCR-produkt ferdûbelet by elke syklus.
·In helling minder as -3.322 (bgl. -3.8) jout in PCR-effisjinsje oan
· In helling grutter dan -3.322 (bgl. -3.0) jout oan dat de PCR-effisjinsje grutter liket te wêzen as 100%, wat nijsgjirrich is, hoe koe ien syklus fan PCR mear as dûbelje it fersterke produkt generearje?Dizze situaasje komt foar yn 'e net-lineêre faze fan' e PCR-reaksje, dat is, d'r is in grut bedrach fan net-spesifike amplifikaasje.
melting kromme
Nei't de qPCR-amplifikaasje foltôge is, wurdt it PCR-produkt ferwaarme.As de temperatuer opkomt, smelt it dûbelstrengige amplifikaasjeprodukt stadichoan, wat resulteart yn in fermindering fan fluorescinsje-yntensiteit.As in bepaalde temperatuer (Tm) wurdt berikt, sil in grut oantal produkten smelte.Fluoreszinsje sakket skerp.Ferskillende PCR-produkten hawwe ferskillende Tm-wearden en ferskillende smelttemperatueren, sadat de spesifisiteit fan PCR kin wurde identifisearre.
Melting curve (derivative curve)
De smeltkurve is ôflaat om in peakkaart te foarmjen, dy't de situaasje fan PCR-produktfragminten yntuïtyf werjaan kin.Sûnt de smelttemperatuer de Tm-wearde fan it DNA-fragmint is, kinne guon parameters dy't ynfloed hawwe op de Tm-wearde fan it DNA-fragmint wurde beoardiele, lykas fragmintgrutte, GC-ynhâld, ensfh.de lingte fan it fersterke produkt is yn it berik fan 80-300bp, dus de smelttemperatuer moat tusken 80 ° C en 90 ° C wêze.
Ynterpretaasje fan de melting kromme: As de ienige wichtichste pyk ferskynt tusken 80 ° C-90 ° C, betsjut dat de fluorescent kwantitative PCR is perfekt;as de wichtichste pyk ferskynt tusken 80 ° C-90 ° C en ferskate toppen ferskine ûnder 80 ° C, de primer dimer wurdt yn prinsipe beskôge.Jo kinne besykje te fergrutsjen de annealing temperatuer te lossen it;as de wichtichste peak ferskynt tusken 80 ° C-90 ° C, en de ferskate peak ferskynt wer as de temperatuer opkomt, wurdt yn prinsipe beskôge dat der DNA-fersmoarging is, en DNA moat fuortsmiten wurde yn 'e earste faze fan it eksperimint.
Fansels binne der noch wat abnormale sitewaasjes, dy't hjirûnder ien foar ien ôfbrutsen wurde.
3. Avansearre kennis
Om qPCR te dwaan, moat ik MIQE sizze,Minimum ynformaasjefoar Publikaasje fanKwantitatyfReal-Time PCREksperiminten - de minimale ynformaasje foar it publisearjen fan artikels oer real-time kwantitative PCReksperiminten.Om it begryp fan elkenien te ferienfâldigjen, sille wy de kaai ynhâld ferienfâldigje.
Jo kinne sykje de oarspronklike tekst fan MIQE op it ynternet, en it wichtichste is dat it bepaalt dedata checklist dy't levere wurde moat by it publisearjen fan in artikel .
Resinsinten kinne de kwaliteit fan it eksperimint beoardielje troch dizze details te lêzen;takomstige lêzers kinne dit ek brûke om it eksperimint te herheljen of te ferbetterjen.
It is de muoite wurdich op te merken dat yn dizze list it belang fan elke list is markearre mei E of D respektivelik.Wat betsjut dat?E: essensjele ynformaasje (moat yntsjinne wurde);D: winsklike ynformaasje (soargje safolle mooglik).
MIQE (1) - Eksperiminteel ûntwerp
In protte scumbags dy't har ferdigening foltôge hawwe nei it foltôgjen fan har ôfstudearstúdzje, sille net witte hoe't se in eksperimint selsstannich ûntwerpe kinne, har notebooks iepenje en dwaan wat de learaar har seit te dwaan.Dêrtroch wie it eksperimintele ûntwerp net strang, en de redaksje fan it blêd sei dat se dizze foto en dy foto meitsje woene, dat se diene it yn 'e dwaze.Dit is hoe't de scumbags wurde makke!
Tichter by hûs is it earste prinsipe fan it eksperimint om te bepalende strangens fan 'e eksperimintele logika.It meast fûnemintele ding is it eksperimintele ûntwerp, en it wichtichste ding oer it eksperimintele ûntwerp is hoe't jo de doelprobe, referinsjeprobe (kontrôle) en it oantal werhellingen ynstelle kinne, sadat de eksperimintele gegevens kinne wurde ferwiisd, fergelykber en oertsjûgjend.
It doel sampleferwiist nei it stekproef dat ús fereasket om it doelgen nei in bepaalde behanneling te ûntdekken.De referinsje sampleis it stekproef sûnder behanneling, dat wurdt faak oantsjutten as wyld type yn biology.
Eksperimintele replikaasjesbinne tige wichtich.Yn 't algemien moat it oantal oertsjûgjende replikaten mear wêze as trije.It is needsaaklik om te ûnderskieden wat biologyske replikaasje is en wat technyske replikaasje is.
Biologyske replikaten: Itselde ferifikaasje eksperimint dien mei ferskate materialen (tiid, planten, batches, reaksje platen).
Biologyske duplikaasje
Litte wy de pestizidbehanneling fan piper as foarbyld nimme.Wy wolle spuite pestiziden op 'e trije planten fan ABC, dan binne de trije planten fan ABC trije biologyske replikaten, en se binne itselde ferifikaasje-eksperimint útfierd mei ferskate materialen.Mar as eksperimint is in kontrôle perfoarst nedich, sadat wy ien fan 'e tûken fan plant A kinne spuite om in eksperimintele groep fan plant A te foarmjen, en de oare tûken fan plant A net spuite om in kontrôlegroep te foarmjen.Doch itselde foar B en C.
Technyske replikaten (Technyske replikaten): It is in werhelle eksperimint ûntwurpen om foar te kommen flaters feroarsake troch operaasje, dat is eins in duplikaat gat opnommen yn itselde materiaal.Sawol behannelingen as kontrôles moatte replikaasjeynstellingen hawwe (minimum trije) fan it doelgen en it ynterne referinsjegen.
Technyske werhelling
Nim nochris de mei pestiziden behannele piper as foarbyld.Foar de eksperimintele groep fan plant A makken wy trije PCR-gaten fan 1, 2, en 3 foar respektivelik syn doelgen en ynterne referinsjegen, om it gemiddelde te nimmen nei de deteksje.Foar de kontrôle fan plant A Groepen wurde ek behannele op deselde wize.Doch itselde behanneling foar B- en C-planten.Dit is technyske werhelling.
It is de muoite wurdich opskriuwen datwat yn 'e statistiken komt is de biologyske werhelling, en de technyske werhelling is om te testen oft d'r willekeurige ferskynsels binne yn it eksperimintele proses, om de eksperimintele resultaten credible te meitsjen, dat is, om flaters te foarkommen troch har gemiddelde te nimmen lykas wy faaks sizze.
Negative kontrôles - NTC en NRT
NTC (No-Template Control), in kontrôle sûnder in sjabloan, wurdt brûkt om te kontrolearjen oft it eksperimintele materiaal is fersmoarge.Algemien wurdt wetter brûkt as sjabloan.As der in fluorescerende reaksje is, jout it oan dat nukleïnesoerfersmoarging yn it laboratoarium plakfûn is.
Dizze fersmoargingen komme út: ûnrein wetter, net kwalifisearre reagenzjes dy't endogene DNA befetsje, primerfersmoarging, fersmoarging fan laboratoariumapparatuer, aerosolfersmoarging, ensfh., moatte RNase scavengers en RNase-ynhibitoren brûke.Aerosolfersmoarging is it dreechst te finen.Stel jo foar dat jo laboratoarium as smog is, mei ferskate nukleïnesoeren yn 'e loft ophongen.
NRT (No-Reverse Transcriptase), de kontrôle sûnder omkearde transkripsje, is it net-omkearde transkribearre RNA as in negative kontrôle, dat is de kontrôle fan gDNA-residu.
By it dwaan fan geneekspresje wurdt de hoemannichte RNA ûntdutsen troch it detektearjen fan it bedrach fan cDNA nei omkearde transkripsje.As d'r gDNA-residu is as RNA wurdt suvere, sil it flaters feroarsaakje yn 'e eksperimintele resultaten, om't de werklike resultaten gDNA en cDNA binne.Op it aggregaatnivo, net allinich cDNA, moat gDNA folslein fuortsmiten wurde tidens RNA-ekstraksje.
MIQE (2) - Sample ynformaasje
De saneamde sample ynformaasje betsjut dat as wy publisearje in artikel oer qPCR, wy moatte ferklearje de sample ynformaasje dúdlik, dat is in ûnmisber diel fan it artikel.As wy samples ferwurkje, moatte wy ek ús eigen operaasjes regelje om de jildigens fan 'e samples te garandearjen.
De beskriuwing fan 'e stekproef is allinich in resultaat, en wy moatte mear omtinken jaan oan de materialen dy't tidens it hiele eksperimint nommen binne.
Seleksje fan eksperimintele materialen
Bloedmonsters - kies farsk bloed, net mear as 4 oeren.Selmonsters - kieze om frisse sellen te sammeljen yn in perioade fan krêftige groei.Animal Tissue-Kies farsk, krêftich groeiende weefsel.Plantweefsel - Kies frisse, jonge weefsel.
Jo moatte opfallen hawwe dat der in kaaiwurd yn dizze pear sinnen sit: farsk .
Foar de boppesteande samples is de bêste, kosten-effektive en stabile kit op 'e merke Foregene's kit, dy't har DNA en RNA fluch en maklik kin ekstrahearje.
Animal Totaal RNA Isolaasje Kit
Plant Totaal RNA Isolaasje Kit
Plant Totaal RNA Isolaasje Kit Plus
Opslach fan eksperimintele materialen
Yn it algemien riede wy net oan om samples op te slaan, as de betingsten it tastean.D'r binne lykwols in protte freonen dy't net direkt nei sampling eksperiminten kinne útfiere, en guon moatte sels floeibere stikstoftanks nei it fjild drage foar sampling.
Foar dit soarte fan hurd wurkjende freon, ik kin allinnich sizze dat jo net begripe reagent verbruiksartikelen.No produsearje in protte bedriuwen dy't konsumpsje reagens reagenzjes dy't RNA-monsters kinne opslaan by keamertemperatuer, en jo kinne kieze om se te brûken.De konvinsjonele opslachmetoade is opslach fan floeibere stikstof, mei in lytse floeibere stikstoftank dy't maklik te dragen is.Nei it bringen fan it monster werom nei it laboratoarium, bewarje it yn in -80 ° C kuolkast.
Foar eksperiminten mei RNA moat it seiswurdprinsipe wurde folge:lege temperatuer, gjin enzymen,enfluch .
It konsept fan lege temperatuer is maklik te begripen;sûnder enzymen is RNase oeral yn 'e wrâld wêryn wy libje (oars soene jo troch HIV fermoarde wêze), dus hoe't jo RNase kinne foarkomme as jo eksperiminten dogge, is in heul wichtich konsept;fluch,D'r is gjin Kung Fu yn 'e wrâld dy't net brutsen wurde kin, allinich snelheid kin net brutsen wurde.
Dêrom, yn in sin, hoe koarter de ekstraksjetiid, hoe better de kit.Wêrom dochtFoarige's kit beklamje snelheid, omdat se witte it goed.
PS: Guon famkes dogge eksperiminten hiel foarsichtich, mar se binne net sa goed as in slam dunk nei ferskate jierren fan wurk.Se fiele dat God ûnrjochtfeardich is, klage oer oaren en sykje nei it libben.Eins begriep se it net.Hy beskerme de RNA net goed, en de slam dunk spiler wie flink.Doe't er it eksperimint die, tocht er dat er de slam dunk ôfmeitsje soe mei trije kear, fiif kear en twa divyzjes, mar hy die it eksperimint goed.
Noat: Stadiger, mear kâns op RNase ynvaazje.Hoe kinne jo josels traine om fluch te wêzen?D'r is gjin manier, gewoan mear oefenje.
Foar ferskate eksperiminten en ferskillende samples is it noch altyd nedich om mear literatuer te lêzen en in passende metoade foar ferwurking te kiezen.Foar it proses foar it sammeljen en opslaan fan samples fereasket MIQE dat it dúdlik yn 'e krante skreaun wurde moat, sadat de resinsinten de betrouberens fan it papier kinne beoardielje, en it is ek handich foar de ferbjustere jongeren om jo eksperimint te werheljen.
Hoewol biologyske eksperiminten lestich binne, binne se heechweardich.As jo net foarsichtich binne, kinne jo de wrâld omkeare.Bygelyks, it meitsjen fan SARS yn in biogemyske krisis, of it meitsjen fan hybride rys om 1,3 miljard minsken te rêden.De foto hjirûnder is in gemysk eksperimint, jo moatte begripe hoe grutsk jo binne op jo ûndersyk gewoan troch te sjen nei syn dick-like uterlik.Ferjit it, swart him net.
MIQE (3) - ekstraksje fan nukleïnesûr.
Nukleïnesûr-ekstraksje is in grut evenemint, en alle molekulêre biologyske eksperiminten begjinne mei nukleïnesûr-ekstraksje.Litte wy earst de ynhâld fan MIQE kopiearje oer ekstraksje fan nukleïnesûr.
As jo nei dizze foarm sjogge, kinne jo net op it oerflak bliuwe.De foarm is in dogma.Om in topstudint te wêzen, moatte jo freegje wêrom.De essensjele ynhâld fan dizze tabel is: Ferfolgjede suverens, yntegriteit, gearhing, en ekstraksje bedrach fan RNA .
It earste diel fan 'eproses as ynstrumint is de nukleïnsûrekstraksjestap.As jo in automatyske nucleic acid extractor brûke om te ekstraheren (avansearre, nim dan kontakt mei my op foar oankeap), moatte jo de modelnamme fan it ynstrumint oanjaan.
De namme fan it kit en
hokker kit waard brûkt foar de feroaring details, hokker spesjale reagents waarden tafoege of wat spesjale operaasjes waarden dien moatte wurde útlein dúdlik sadat oaren kinne maklik werhelje jo eksperimint.
Guon minsken foegje wat spesjale reagents ta by it útlûken fan spesjale samples, tinke dat dit har geheime wapen is en fertel oaren net.Wylst se it geheim hâlde, ferlieze se ek de kâns om jo artikel te skinen.Wês net tûk, jo moatte earliker wêze as it lân âlde Zhang yn wittenskiplik ûndersyk, as jo tûk wêze wolle, sil it artikel jo dom meitsje.
moat it produktnûmer fan 'e kit ûnthâldeas jo de kit bestelle en it artikel skriuwe.D'r binne oer it algemien twa nûmers op 'e kit: Kat-katalogusnûmer (produktnûmer, artikelnûmer), Lot-produktpartijnûmer (Brûkt om oan te jaan út hokker partij it produkt kaam).
Derneist wurdt it CAS-nûmer faak brûkt by it bestellen fan biogemyske reagenzjes, en ik sil it tegearre popularisearje.It CAS-nûmer is it nûmer dat troch de American Chemical Society wurdt jûn oan elk nij gemysk medisyn.Algemien binne trije nûmers ferbûn troch in streepke.Rushui's CAS-nûmer: 7732-18-5.Chemicals hawwe faak meardere aliassen, mar it CAS-nûmer is unyk.By it bestellen fan medisinen kinne jo earst it CAS-nûmer kontrolearje.
Dichter by hûs, wêrom moatte wy dizze dingen dúdlik beskriuwe?Yn feite is it ek om de kwaliteit fan RNA-ekstraksje te kontrolearjen.It gebrûk fan ynstruminten en kits sil RNA-ekstraksje konsekwinter meitsje.De ekstraksjeskaal fan gewoane laboratoaren is net grut, en it kin wurde krigen mei kits.
De details fan DNase of RNase behanneling
It wichtige probleem fan fluorescent kwantitative PCR is om DNA-fersmoarging te foarkommen, en eksperimintearje net as d'r kontaminaasje is.Dêrom is it ymperatyf om it proses oan te jaan dat jo brûkt hawwe om it DNA te ferwurkjen, om te demonstrearjen dat it DNA yn it eksperimintele proses folslein en folslein fuorthelle is.fertsjintwurdige troch in skematyske diagram.
Skematyske diagram fan RNA en DNA
Yn 't algemien is de metoade foar it fuortheljen fan DNA om RNA te behanneljen mei DNase nei ekstraksje.Dit binne lykwols relatyf âlde metoaden.Kommersjele RNA-ekstraksjekits binne yn steat west om DNA te ferwiderjen tidens it ekstraksjeproses sûnder DNase ta te foegjen.Bygelyks, in rige fan kits út Foregene.
Noat: Fuortsmite fan DNA tidens RNA-ekstraksje is in heul gefaarlik dûbelsnijd swurd, dat de operaasjetiid fan RNA-ekstraksje sil ferlingje en it risiko fan RNA-degradaasje ferheegje.Yn prinsipe is it in ôfwikseling tusken RNA-opbringst en suverens.
Derneist is de hoemannichte DNase tafoege oan 'e silika-basearre adsorpsjekolom heul lyts, en DNase fan hege kwaliteit moat brûkt wurde om it effekt te berikken.Unoptimisearre DNase kin net fluch en folslein fertarre wurde.Dit is in test fan it technyske nivo fan 'e keapman.Fansels binne d'r noch mear nuvere keaplju dy't opskeppe dat DNA sûnder DNase fuorthelle wurde kin.It kin sein wurde dat elkenien dy't bracht dat DNA folslein fuorthelle wurde kin sûnder DNase in hooligan is.DNA is in relatyf stabile dûbelstrengige struktuer, en it kin net wiske wurde troch gewoan te praten en te laitsjen.
Beoardieling fan fersmoarging
beoardielingsmetoade: elektroforesedeteksje, 1% agarose, 6V/cm, 15min, laden 1-3 ul
Nucleic acid kwantitative analyze
wurdt normaal metten mei in UV-spektrofotometer.Lit my earst de betsjutting fan 'e trije wearden fan OD260, OD280 en OD230 popularisearje.
· OD260nm: It is de absorption golflingte fan 'e heechste absorption pyk fan nucleic acid, en de bêst mjitten wearde farieart fan 0,1 oant 1,0.As net, ferwiderje of konsintrearje it stekproef om it binnen berik te bringen.
· OD280nm: It is de absorption golflingte fan 'e heechste absorption pyk fan proteïne en phenolic stoffen.
· OD230nm: It is de absorption golflingte fan de heechste absorption pyk fan koalhydraten.
Folgjende, litte wy prate oer de rol fan elke yndikator.Foar A260 kin it brûkt wurde om de opbringst fan nukleïnesûr te mjitten.As OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.
Foar suverens moatte wy sjen nei de ferhâldingen dy't wy gewoanlik sjogge: OD260/280 en OD260/230.
· Pure DNA: OD260/280 is likernôch gelyk oan 1,8.As it grutter is as 1,9, jout it oan dat der RNA-fersmoarging is, en as it minder is as 1,6, jout it oan dat d'r proteïne- en fenolfersmoarging is.
· Pure RNA: 1,7
·OD260/230: Oft it no DNA of RNA is, de referinsjewearde is 2,5.As it minder is as 2,0, jout it oan dat der fersmoarging is fan sûker, sâlt en organysk materiaal.
RNA yntegriteit
It is heul wichtich om de yntegriteit fan RNA te mjitten.Yn 't algemien is it nedich om in RNA-denaturaasjegel-eksperimint te dwaan om te kontrolearjen oft de helderheid tusken 28S en 18S RNA in twa-fold relaasje is.As de tredde band 5S ferskynt, betsjut it dat it RNA begon te degradearjen, útsein ynvertebraten.
Gegevens foar beoardieling fan RNA-kwaliteit: Neist de boppesteande tests binne d'r ek wat mear avansearre ynstruminttests yn termen fan RNA-yntegriteit, lykas de RQI-yntegriteitstest fan it Experion automatyske elektroforesesysteem, dat kin ûntdekke oft RNA ûnsichtber is degradearre.
Yn wittenskiplik ûndersyk is fluorescent kwantitative PCR in ferliking tusken it doelgen en it ynterne referinsjegen.Dêrom, yn it proses fan RNA-monsterbehâld, RNA-ekstraksje, ensfh., It primêre doel is om de yntegriteit fan RNA te garandearjen.
Hoe't de yntegriteit fan RNA it lykwicht tusken it doelgen en it ynterne referinsjegen beynfloedet, kin maklik wurde begrepen út 'e figuer hjirûnder.Degradaasje sil liede ta ûnfolsleinens fan genen, of it no de ûnfolsleinens is fan it ynterne referinsjegen of de ûnfolsleinens fan it doelgen, it sil in grutte ynfloed hawwe op 'e gegevens.
Skematysk diagram fan doelgen en referinsjegen, moat net wier wêze
Inhibysjetest (oft de CT-wearde ûnder hege of lege konsintraasje of oare betingsten wurdt ûnderdrukt)
Troch dizze figuer as foarbyld te nimmen, binne de Ct-wearden fan 'e fiif bochten as folget.De ferdieling fan CT-wearden tusken de bochten is unjildich, en de Ct-wearden wurde fertrage ûnder hege en lege konsintraasjes, wat it gefal is fan PCR-remming.
Wichtich punt: Yn it proses fan RNA-ekstraksje moatte wy misferstannen ferlitte en korrekte fêststelle.
It ferkearde idee is: RNA-ekstraksje ferfolget allinich de opbringst, tinkend dat hoe grutter de hoemannichte RNA krige, hoe better.Yn feite, as wy kwantifikaasje dogge, as it oantal genen net heul grut is, hawwe wy net folle RNA nedich.De hoemannichte RNA dy't jo ekstrahearje is mear dan genôch.
It juste konsept is:RNA-ekstraksje moat suverheid, yntegriteit en konsistinsje stribjen.Purity kin derfoar soargje dat de folgjende reverse transkripsje net wurdt ynhibeare en de gegevens sille net wurde beynfloede troch DNA.Yntegriteit soarget foar it lykwicht fan doelsekwinsjes en ynterne referinsjes.Konsistinsje soarget foar stabile sample laden.
MIQE (4) - omkearde transkripsje
Misbegryp: it stribjen nei hegere sample folume.
Korrekte konsept: Stribje konsistinsje (stabiliteit), nettsjinsteande de hoemannichte RNA laden, de effisjinsje fan omkearde transkripsje bliuwt konsekwint, en soarget derfoar dat ferskillen yn cDNA wirklik ferskillen yn mRNA kinne reflektearje.
Wy ferklearje dit proses mei in skematysk diagram:
Skematysk diagram fan effisjinsje fan omkearde transkripsje, wês net wier
Alderearst moatte wy it ferskil begripe tusken it omkearde transkripsjeproses en it PCR-proses.PCR ûndergiet meardere ferwaarming en annealing prosessen, en it doel fragmint groeit eksponentiell;wylst omkearde transkripsje dit proses net hat, kinne wy ús yntinke dat omkearde transkripsje eins ien-op-ien is Tidens it replikaasjeproses, safolle stikken RNA
sa't d'r safolle stikken cDNA-ynformaasje kinne krije, moat it no begrepen wurde, om't fragminten grut en lyts binne omkeard transkribearre, en it is ûnmooglik om te rjochtsjen op ien fragmint.En om't de hoemannichte RNA relatyf lyts is, is de hoemannichte krigen cDNA ek relatyf lyts, yn tsjinstelling ta PCR, dy't in amplifikaasje-effekt hat, dus it is yn prinsipe ûnmooglik te ûntdekken.
cDNA elektroforese resultaten
Twad, ideaal, omkearde transkripsje wurdt ien-op-ien útfierd, mar gjin omkearde transkriptase fan in bedriuw kin dit effekt berikke.Yn prinsipe swalket de effisjinsje fan de measte reverse transkriptases tusken 30-50%.As dit it gefal is, soene wy leaver in relatyf stabile omkearde transkripsje-effisjinsje hawwe, dat is wat wy yn 'e figuer sjen wolle: 3 RNA's krije 2 cDNA's, 6 RNA's krije 4 cDNA's, dus nettsjinsteande hoefolle sample wurdt laden, de reverse-transkripsje-effisjinsje is relatyf stabyl.Wy wolle de situaasje net sjen wêr't effisjinsje fan reverse transkripsje ynstabyl is en hege konsintraasje wurdt ynhibeare.
Dat, hoe kinne jo kontrolearje oft de effisjinsje fan omkearde transkripsje stabyl is?De metoade is heul ienfâldich, jo hoege allinich in fergelikingstest te dwaan: ien is omkearde transkripsje yn cDNA nei ferdûbeling fan RNA, en de oare is om ferdûbeling te meitsjen nei reverse transkripsje yn cDNA, en dan qPCR dwaan om de krigen helling te sjen Is it konsekwint.As topstudint moatte jo it yn sekonden begripe.As hjirûnder werjûn:
Verdunning fan RNA en cDNA om te testen oft de effisjinsje fan reverse transkripsje stabyl is
Reverse transkriptase en kit
Hoe kin perfekte fluorescent kwantitative PCR poerbêste reverse transkriptase en kit hawwe.Omkearde transkriptase wurdt rûchwei ferdield yn twa soarten neffens de boarne, AMV ofM-MLV, en harren prestaasje is itselde as dat werjûn yn 'e tabel.
RNase H aktiviteit
RNase H is Ribonuclease H, de Sineeske namme is ribonuclease H, dat is in endoribonuclease dat spesifyk RNA kin hydrolysearje yn 'e DNA-RNA hybride keten.RNase H kin de phosphodiester-obligaasjes net hydrolysearje yn ienstrengige of dûbelstrengige DNA of RNA, dat wol sizze, it kin ienstrengige of dûbelstrengige DNA of RNA net fertarje.Faak brûkt yn 'e synteze fan' e twadde strân fan cDNA.
It is in nuver ding.Wy sizze dat omkearde transkriptase RNase H-aktiviteit hat, net dat omkearde transkriptase RNase H befettet, en it kin net mooglik wêze om RNase H te skieden fan omkearde transkriptase, miskien fanwegen de konformaasje fan bepaalde groepen yn omkearde transkriptase Dizze aktiviteit wurdt feroarsake troch de omkearde transkriptase.
Dêrom, nettsjinsteande de hegere omkearde transkripsje-effisjinsje fan AMV, ferminderet har RNase H-aktiviteit de opbringst fan cDNA.Fansels optimalisearje reagensfabrikanten har produkten konstant om RNase H-aktiviteit yn reverse transkriptase safolle mooglik te eliminearjen om de opbringst fan cDNA te ferheegjen.
Annealing temperatuer
Sekundêre struktuer fan RNA by ferskate temperatueren
Sjoch de figuer hjirboppe foar de sekundêre struktuer fan RNA by ferskate temperatueren, en brûk it mFold online ark om de sekundêre struktuer fan it doelfragmint te bepalen ûnder spesifike temperatuer- en sâltkonsintraasjebetingsten.By 55 ° C is de sekundêre struktuer fan it RNA noch heul kompleks, reverse transkriptase kin net wurkje, en de sekundêre struktuer kin net folslein oplost wurde oant 65 ° C, wylst de optimale temperatuer fan AMV en M-MLV folle leger is as dizze temperatuer.
wat te dwaan?De sekundêre struktuer is de komplemintêre pairing fan it sjabloan sels, dy't liedt ta sterke konkurrinsje tusken de primer en reverse transkriptase en it sjabloan, resultearret yn in rige problemen lykas lege E en min repeatability.
wat te dwaan?Ferheegje de annealingtemperatuer allinich safolle mooglik.
In protte reagensfabrikanten ferbetterje har reverse transkriptase troch genetyske technyk.Guon ferheegje de reaksjetemperatuer, lykas Jifan en Aidelai, en guon ferwiderje de aktive groep fan RNase H-enzyme om de affiniteit tusken it enzym en it RNA-sjabloan te ferbetterjen.Hege affiniteit kin kompetitive squeeze út de sekundêre struktuer en lêzen troch soepel, en ek gâns ferbetterje de effisjinsje fan reverse transkripsje.
Kaaipunt: Omkearde transkripsje is wichtiger om de konsistinsje fan effisjinsje fan omkearde transkripsje nei te stribjen (enzymen moatte net allinich effisjint wêze, mar ek stabyl), yn stee fan de hoemannichte sample laden, as it net in bysûnder grutskalige fluorescent kwantitative PCR is, sil it hielendal net mooglik wêze.Meardere cDNA's.
Ferskate fabrikanten hawwe ek wat ynspanningen dien yn it stribjen nei konsistinsje.Bygelyks, de measte bedriuwen hawwe no omkearde transkripsje ynpakt as in standert kit te keap, wat in goede kar is.
Bygelyks, Foregene's RT Easy Series-kits:
RT Easy I (Master premix foar earste streng cDNA synthese kit)
MIQE (5) - doelgenynformaasje
De boppesteande figuer ferklearret
1. Oft dit gen effektyf is foar werhelle eksperiminten kin algemien wurde ferifiearre troch werhelle eksperiminten.
2. Gene ID, do witst.
3. Gene lingte, de totale lingte fan it doel gen is perfoarst gjin probleem.By it ûntwerpen fan primers, soargje derfoar dat de lingte fan it amplicon tusken 80-200bp is om in bettere amplifikaasje-effisjinsje te garandearjen.
4. Sequence Blast ferliking ynformaasje, it doel gen moat wurde fergelike yn genebank om foar te kommen net-spesifike amplification.
5. Oanwêzigens fan pseudogenes.In pseudogen is in DNA-sekwinsje fergelykber mei in normaal gen, mar ferliest syn normale funksje.It bestiet faak yn 'e meargenenfamylje fan eukaryoten.It wurdt normaal fertsjintwurdige troch ψ.It is in net-funksjonele genomyske DNA-kopy yn it genoom dy't heul gelyk is oan 'e kodearjende gensekwinsje., wurde oer it generaal net transkribearre, en hawwe gjin dúdlike fysiologyske betsjutting.
6. Posysje fan primers relatyf oan exons en introns.Yn 'e iere jierren, doe't wy it probleem fan DNA-fersmoarging oplosten, hawwe wy faak omtinken jûn oan' e posysjes fan primers, exons en introns, en oer it algemien beskôgen wy it ûntwerpen fan primers oer introns om DNA-amplifikaasje te foarkommen.Sjoch asjebleaft de figuer hjirûnder: swart stiet foar introns, ferskate blues fertsjintwurdigje eksons, roze fertsjintwurdiget gewoane primers, en helder read stiet foar intron-spannende primers.
Skematysk, nea wier
Wat in perfekte plan dit liket, mar yn feite, yn 'e measte gefallen, de trans-intron primers binne net sa magysk as foarsteld, en se sille ek feroarsaakje net-spesifike amplification.Dus de bêste manier om DNA-fersmoarging te foarkommen is DNA folslein te ferwiderjen.
7. Conformation foarsizzing.Brûk dit foarbyld wer, brûk it mFold online ark om de sekundêre struktuer fan it doelfragmint te bepalen by in spesifike temperatuer en sâltkonsintraasje.
Sekundêre struktuer fan RNA by ferskate temperatueren
De sekundêre struktuer is de komplemintêre pairing fan it sjabloan sels, dat sil liede ta sterke konkurrinsje tusken de primer en template pairing, en de kânsen fan primer bining binne minder, resultearret yn in rige problemen lykas lege E en min repeatability.Troch softwarefoarsizzing, as d'r gjin sekundêr struktuerprobleem is, soe dat geweldich wêze.As d'r is, sil ús folgjende artikel spesifyk beprate hoe't jo dit probleem oplosse kinne.
MIQE (6) -qPCR Oligonucleotides
Foar fluorescent kwantitative PCR is it earste ding dat jo elke dei wrakselje mei RNA-ekstraksje, en it twadde ding kin primerûntwerp wêze.
Alderearst kontrolearje wy noch de regels oer primerûntwerp neffens de MIQE-checklist.It is sa ienfâldich dat de scumbags laitsje kinne, en wy kinne it yn ien sin ôfmeitsje: fyn de folchoarder en posysje fan 'e primersonde en de modifikaasjemetoade.Foar de primer suvering metoade, primer synteze is sa goedkeap op it stuit, qPCR is weardich PAGE en boppe suvering metoaden, en de ynformaasje fan de synteze ynstrumint is net wichtich.In protte minsken hawwe al tsientallen jierren primers dien en witte net dat de synthesizer ABI3900 is.
Oangeande de begjinsels fan primer design, Jo hoege net te ûnthâlden se by rote, omdat de measte primer design software of online ark kinne soargje foar dizze problemen (oanrikkemandearre online ark primer3.ut.ee/), en 99,999% fan primer design wurdt net dien mei de hân Sjoch, de skriuwer soms ûntwerpt hûnderten primers in dei, as jo lêze ien krús-by ien.
Kontrolearje gewoan de folgjende punten nei't de primers binne ûntwurpen:
1. Untwerpprimers tichtby it 3'-ein: Yn it gefal fan it brûken fan oligo dT-primers foar cDNA-earste-stringsynthese, sjoen de effisjinsje fan omkearde transkripsje en RNA-yntegriteit, moatte de ûntworpen primers tichtby it 3'-ein ûntworpen wurde om amplifikaasje-effisjinsje te ferbetterjen.Brûk in ôfbylding om as folgjend út te lizzen (d'r is gjin manier om dit te begripen):
Wêrom moatte primers wurde ûntwurpen tichtby de 3 'ein, it moat net wier wêze
2. TM-wearde: De Tm-wearde is by 55-65 ° C (om't de exonuklease-aktiviteit de heechste is by 60 ° C), en de GC-ynhâld is op 40% -60%.
3. BLAST: Om foar te kommen net-spesifike amplification fan it genoom, Blast moat brûkt wurde foar oanfoljende ferifikaasje.
MIQE (7) - qPCR proses
1. qPCR kit
Neffens de easken fan MIQE moatte wy de folsleine reaksjebetingsten yn it artikel dúdlik beskriuwe, ynklusyf de konfiguraasje fan it PCR-reaksjesysteem, hokker kit wurdt brûkt, wa is de fabrikant, hoe grut is it reaksjesysteem, oft de kleurmetoade of de probemetoade wurdt brûkt, PCR-programmaynstellingen.Veteran sjauffeurs sille grif fine dat sa lang as de kit is selektearre, de boppesteande ynformaasje wurdt yn prinsipe bepaald.
Op it stuit is de fabrikaazje en produksje fan fluorescent kwantitative PCR-kits in heul folwoeksen technology.Salang't jo gjin ekstreem minne fabrikanten kieze, is de kâns op problemen net heech, mar wy wolle dochs in pear punten mei jo diele:
Hot-start Taq enzyme:It wichtichste diel fan PCR is it hot-start Taq enzyme.De hot-start-enzymen op 'e merk binne oer it generaal ferdield yn twa soarten, ien is in gemysk modifisearre hot-start-enzyme (jo kinne it yntinke as paraffine-ynbêding), en de oare is Is in hot-start-enzyme foar antykodymmodifikaasje (antigen-antibody binding).Gemyske modifikaasje is in betide manier fan hot-startende enzymen.As in bepaalde temperatuer wurdt berikt, sil it enzym syn aktiviteit frijlitte.It antybody-modifisearre hot-start enzyme brûkt biologyske metoaden om de aktiviteit fan it enzym te blokkearjen.As in bepaalde temperatuer wurdt berikt, sil it antykodyk denaturearre en ynaktivearre wurde as in proteïne, en de enzymaktiviteit sil yn spiel brocht wurde.
Lykwols, wat is it nut fan dit?Dit is it gefal, de frijlittingaktiviteit fan antybody-modifisearre enzymen is flugger as dy fan gemysk modifisearre enzymen, dus yn termen fan gefoelichheid hawwe antibody-modified enzymen in lyts foardiel, sadat d'r yn prinsipe gjin gemysk modifisearre enzymen binne yn 'e kits op' e merk.As der is, dan is de technology fan dizze fabrikant noch fêst yn it tiidrek fan it millennium.
Magnesiumionkonsintraasje:Magnesiumionkonsintraasje is heul wichtich yn 'e PCR-reaksje.Passende magnesiumionkonsintraasje kin de frijlitting fan Taq-enzymaktiviteit befoarderje.As de konsintraasje te leech is, sil de enzymaktiviteit signifikant fermindere wurde;as de konsintraasje te heech is, sil de enzyme-katalysearre net-spesifike amplifikaasje ferbettere wurde.De konsintraasje fan magnesium-ionen sil ek beynfloedzje de annealing fan primers, de smelttemperatuer fan 'e sjabloan en PCR-produkten, en beynfloedet dêrmei de opbringst fan fersterke fragminten.De konsintraasje fan magnesiumionen wurdt oer it generaal regele op 25mM.Fansels, foar in goede kit moat de konsintraasje fan magnesium-ionen goed kontrolearre wurde.Guon keaplju foegje in magnesium ion chelating agent oan it reagens, dat kin berikke it effekt fan automatyske oanpassing fan de magnesium ion konsintraasje.
Fluorescent kleurstof konsintraasje:Fluorescent kleurstof, dat is de SYBR Grien wy meastentiids brûke, foaral genereart fluorescence troch bining oan de lytse groove fan dûbele-strâne DNA, omdat de bining fan de kleurstof oan dûbele-strâne DNA is net-spesifike, dat wol sizze Sa lang as dûbele-strâne DNA wurdt kombinearre mei it, fluorescence kin foarkomme, sa sil kombinearje primer-dimers mei primer-dimers en sil kombinearje sjabloanen yn it systeem.
PS: Troch syn ljochtgefoelige eigenskippen wurde produkten op 'e merke oer it generaal ferpakt yn brune opake sintrifugebuizen (lykas werjûn yn' e ôfbylding hjirûnder).Dit sil lykwols in probleem tsjinkomme.It is lestich om te sjen oft de floeistof wurdt sûge by sampling.Wat dat oanbelanget is Qingke yndie de meast brûkerfreonlike (lykas werjûn yn 'e ôfbylding hjirûnder), en de transparante buis is yn in ûntrochsichtich tin tas ferpakt.Dan set it yn in tin tas, rekken hâldend mei it gemak fan it foarkommen fan ljocht en sampling.Jo moatte it juste produktnûmer kieze.TSE204 is in super kosten-effektyf bestean, dat makket my wol te plantsjen gers.
De konsintraasje fan de fluorescent kleurstof is ek tige wichtich.As de konsintraasje te leech is, sil de amplifikaasjekromme yn it lettere stadium net omheech gean en is net perfekt;as de konsintraasje te heech is, sil it lûdferoaring feroarsaakje.Sûnt de fluorescent kwantitative PCR benammen hinget ôf fan de CT wearde, as de konsintraasje fan de fluorescent kleurstof is net goed oanpast, it lege punt is better as it hege punt.Fansels is de passende kleurstofkonsintraasje it bêste.
ROX: ROX kleurstoffen wurde brûkt om te korrigearjen foar goed-to-well fluorescence sinjaal flaters.Guon ynstrumintfabrikanten fereaskje kalibraasje, wylst oaren net.Bygelyks, it brûken fan Thermo Fisher Scientific syn Real Time PCR amplification ynstrumint meastal fereasket kalibraasje, ynklusyf 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, ensfh De algemiene kit ynstruksjes sille beskriuwe it.
Foregene's qPCR Mix befettet ek ROX-ferve, dy't handich is foar gebrûk yn ferskate modellen.
Swakke wetterstofbân behanneling: De behanneling fan swakke wetterstofbânen is in relatyf technyske saak.Neat hat de hantliedingen fan in protte kits lêzen, mar gjinien fan har neamde dit ûnderwerp.Yn feite is it sa wichtich.De kombinaasje fan basen is benammen ôfhinklik fan de sterkte fan wetterstofbânen.Sterke wetterstofobligaasjes binne normale amplifikaasje, en swakke wetterstofobligaasjes liede ta net-spesifike amplifikaasje.As swakke wetterstofbindingen net goed kinne wurde elimineare, kin net-spesifike amplifikaasje net foarkommen wurde.Binnen it ramt fan 'e skriuwer hawwe mar in pear bedriuwen dit probleem opmurken.As jo de kit keapje, kinne jo ferwize nei oft jo in oplossing yn dit ferbân hawwe beskôge foar de kit dy't jo wolle kieze.
Reaksje folume: It 20-50ul-systeem wurdt faker brûkt, en lytsere folumes sille wierskynlik flaters feroarsaakje.Yn 't algemien sille de ynstruksjes fan' e kit it gebrûk fan PCR-reaksjevoluminten oanbefelje.Wês net tûk en brûk lytsere folumes om kosten te besparjen.it doel fan.It folume oanrikkemandearre troch de keaplju is eins hifke, en it kin wêze dat se kinne net oplosse it probleem fan flaters feroarsake troch lytse folumes.
2. De fabrikant en artikelnûmer fan 'e buisplaat
Elkenien wit it prinsipe fan fluorescent kwantitative PCR.Fluorescence-kolleksje wurdt benammen útfierd fia PCR-buiskappen.By it kiezen fan PCR-verbruiksartikelen, betelje omtinken oan twa punten: goede ljochttransmission en geskikt foar it ynstrumint.Yn 't algemien binne de boerden en buizen fan mainstream-merken goed, mar jo moatte foarsichtich kieze yn termen fan oanpassing, oars kinne jo it ynstrumint net brûke.
4. Top nivo kennis
MIQE (8) -qPCR falidaasje
Dit is de topprioriteit fan qPCR!Safolle helden binne hjir yn it sân fallen.Fansels is it ek mooglik dat jo gelok hawwe en de genen dy't jo studearre binne ienfâldich, sadat jo troch de iishol lâns de wyn sweeven.De ferifikaasjeynformaasje fan qPCR is bedoeld om de betrouberens fan 'e gegevens te testen.Wy listje de nedige ferifikaasjeynformaasje as folget:
1. Spesifisiteit test
De spesifisiteit fan doelgenamplifikaasje wurdt hifke troch te kontrolearjen oft it elektrophoresisbyld in inkele band is;ferifikaasje fan folchoarder;smeltkurve om te sjen oft de pykkaart ien is;ferifikaasje fan enzyme digestion en oare metoaden.
Hjir rjochtsje wy ús op thy analyze fan net-spesifike amplification mei help fan de metoade fan melting curves.Yn 't algemien, as wy primers ûntwerpe, is de grutte fan it produktfragmint ferplicht yn it berik fan 80-200bp, wat de smelttemperatuer fan it PCR-produkt 80-85 °C berik makket.Dêrom, as d'r ferskate peaks binne, moatte d'r oare net-spesifike amplifikaasjeprodukten wêze;as de pyk ûnder 80 ° C ferskynt, wurdt it algemien beskôge as in primer dimer;as de peak boppe 85 ° C ferskynt, wurdt it algemien beskôge as DNA-fersmoarging of mear Nonspecific amplification fan grutte fragminten.
Opmerking: Soms is d'r mar ien pyk by 80 ° C.Op dit stuit moat dit konsept wurde folge.It is wierskynlik dat de amplifikaasjeresultaten allegear primerdimers binne.
Normale smeltkurve (ienige pyk sûnder net-spesifike amplifikaasje)
Problematyske smeltkurve (net-spesifike amplifikaasje fan falske peaks)
【Gefalsanalyse】
Der is in wichtichste pyk, mar de primer dimer is serieus
De single-peak smeltkurve yn 'e figuer hjirûnder kin jo eagen maklik ferrifelje, tinke dat it in perfekt eksperimint is, mar it resultaat is folslein ferkeard.Op dit stuit moatte wy nei de smelttemperatuer sjen.De peak temperatuer is ûnder 80 ° C, dat is folslein primer-dimer.
Gjin doelfragmint, alle primerdimers
Hjir kin myn broer net ophâlde.De foto hjirûnder is in foto dy't makke is mei in mobile telefoan dy't my stjoerd is troch in scumbag.De reagentia dy't hy brûkte binne allegear gewoan brûkte merken yn 'e yndustry.Hy feroare fan ien T-prefix-merk nei in oar T-prefix-merk.Ik tink dat jo it al rieden hawwe.De skuorre rôp tsjin my: "It reagens dat yn 'e earste foto brûkt waard is te goed, en de pyk is ien.Letter, nei it brûken fan it reagens dat jo oanrikkemandearre hawwe, wurdt it as de twadde ôfbylding, mei mingde peaks.Do hast my mislik makke."
Skied de twa grafiken.Op it earste each hat de iene in inkele pyk, en de oare hat in dûbele pyk.Onzin, in inkelde pyk is fansels prima.Is dat wier?
Slimmer as Dou E, as ik de twa foto's yn 'e foto hjirûnder set, sille jo fuortendaliks begripe.Yn feite, wy binne maklik ferlamme troch dit soarte fan byld.Nei soarchfâldige analyze, wy fûnen dat: de peak fan de earste figuer is by 75 ° C, dat is folslein primer dimer;de peak fan de twadde figuer ferskynt op 75 ° C en 82 ° C, op syn minst der binne It produkt ferskynt.
Foto's fan feedback fan studinten
Dat it fûnemintele probleem is net it probleem fan reagentia, mar it probleem fan primerûntwerp.Tagelyk bewiist it ek dat guon grutte merken net fan izeren kwaliteit binne, en it bewiist ek wat myn broer earder sei: It is net it reagensmerk dat jo artikel stipet.It is jo artikel dat it merk fan reagenzjes opstie.Stel jo gewoan foar, as de scumbag de reagenzjes net feroare, soene de ferkearde gegevens nei it tydskrift stjoerd wurde, en wat soe barre soe in trageedzje wêze.
2. Ct wearde fan lege kontrôle
Net útlizze, as de lege kontrôle hat in Ct wearde, is it net fersmoarging?Jo moatte lykwols noch begripe hokker lege kontrôle in Ct-wearde hat.As it NTC is, betsjut dit dat d'r frjemde DNA is lykas reagenskontaminaasje.As it NRT is, betsjut it dat it ekstrahearre RNA DNA-fersmoarging hat.
3. Standert kromme
Ynklusyf de hellings- en berekkeningsformule kin de PCR-effisjinsje wurde berekkene fia de formule.In perfekt eksperimint fereasket dat de helling fan 'e standertkromme 3.32 benaderet, en R² om 0.9999 te benaderjen.
4. Lineêre dynamyske berik
It dynamyske berik fan 'e reaksje is lineêr.Neffens it sjabloan brûkt foar it generearjen fan de standert kromme, it dynamyske berik moat befetsje op syn minst 5 konsintraasje gradients, en betelje omtinken oan de feroaring fan Ct wearden by hege konsintraasje gradients en lege konsintraasje gradients.
5. Detection accuracy
Feroarings yn qPCR-resultaten, dat is, minne repeatability, dat is min presyzje, wurde feroarsake troch in protte faktoaren, ynklusyf temperatuer, konsintraasje en operaasje.qPCR-precision wurdt oer it generaal minder kontrolearber as it oantal kopieën nimt ôf.Ideaallik binnen-eksperimintele fariaasje, dizze technyske fariaasje moat wurde ûnderskieden fan biologyske fariaasje, en biologyske replicates kinne direkt adres statistyske ferskillen yn qPCR resultaten tusken groepen of behannelingen.Benammen foar diagnostyske assays moat de bêste inter-assay-precision (repetabiliteit) oer siden en operators wurde rapportearre.
6. Deteksje-effisjinsje en LOD (yn multiplex qPCR)
LOD is de leechste konsintraasje fan 95% fan positive ûntdutsen samples.Mei oare wurden, de konsintraasje fan LOD befette binnen in set fan doelgen-replikaten moat net mear wêze as 5% fan 'e mislearre reaksjes.By it dwaan fan multiplex qPCR-analyze, benammen foar simultane detectie fan puntmutaasjes of polymorphismen, moat multiplex qPCR bewiis leverje dat de krektens fan meardere doelfragminten net kompromitteare is yn deselde buis, meardere deteksje en single-buisdeteksje Effisjinsje en LOD moatte itselde wêze.Benammen as doelgenen mei hege konsintraasje en doelgenen mei lege konsintraasje tagelyk wurde fersterke, moat dit probleem omtinken jûn wurde.
Problemen en oplossingsYn 't algemien rjochtsje de problemen dy't faak tsjinkomme yn qPCR-debuggen op de folgjende aspekten:
· nonspecific amplification
· Moeilike kar fan primerkonsintraasje en problemen mei primer-dimers
· De annealing temperatuer is net krekt
· Sekundêre struktuer beynfloedet amplification effisjinsje
net-spesifike amplifikaasje
net-spesifike amplificationfoarkomt, wurdt it algemien beskôge as it primerûntwerp net geskikt is, mar as jo net haast hawwe om de primers te feroarjen, kinne jo earst de folgjende metoaden besykje (it prinsipe is ek taheakke):
· Ferheegje de annealing temperatuer - besykje te meitsje swak wetterstof obligaasjes net by steat te behâlden;
· Ferkoartje annealing en elongation tiid - ferminderje de kâns op swak wetterstof obligaasjes;
· Ferminderje primerkonsintraasje - ferminderje de kâns op bining fan oerstallige primers en net-doelregio's;
Low amplification effisjinsje
De tsjinoerstelde situaasje foar net-spesifike amplifikaasje - lege amplifikaasje-effisjinsje, en de maatregels om te gean mei lege amplifikaasje-effisjinsje binne krekt it tsjinoerstelde:
· Ferlingje de annealing en elongation tiid;
· Feroarje nei trije-stap PCR en ferminderje de annealing temperatuer;
· Ferheegje de primerkonsintraasje;
Ps: In protte ôfstudearstudinten berne yn 'e jierren '90 binne net ree om te studearjen hoe't jo eksperiminten kinne debuggen, en hoopje dat de kit it probleem folslein kin oplosse (as jo nei it ôfstudearjen nei in reagensbedriuw wolle gean om ûndersyk en ûntwikkeling te dwaan), yn feite tinke de reagensfabrikanten ek op dizze manier, ik hoopje dat it in gek is. absorption faktoaren.Om it probleem maklik op te lossen, moatte dwazen noch de yntroduksje fan it reagensbedriuw lêze om te sjen oft der in faktor is dy't swakke wetterstofbânen absorbearret.
Moeilike kar fan primerkonsintraasje en problemen mei primer-dimers
Metoade 1: Yn 't algemien hawwe de kit ynstruksjes foar qPCR oanbefellende systemen en oanrikkemandearre primerkonsintraasjes.
Metoade 2: Debuggen troch it ynstellen fan de primerkonsintraasjegradient.De foto hjirûnder is stellen fan in bedriuw om te yllustrearjen.De figuer hjirûnder lit de kwantitative resultaten fan fluorescence sjen makke mei trije primerkonsintraasjegradiënten (100nM, 250nM, 500nM) en fjouwer sjabloankonsintraasjegradiënten (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).De Ct-wearde fan 'e eksperimintele resultaten wurdt as folget útset:
Primerkonsintraasjeseleksje Ferbine elke primerkonsintraasje yn in line as folget:
De kar fan primerkonsintraasje is fanselssprekkend, de lineêre relaasje fan 'e primerkonsintraasje fan 100nM en 250nM is better, en de lineêre relaasje fan 'e primerkonsintraasje fan 500nM is relatyf min.Yn 100nM en 250nM is de Ct-wearde fan 250nM relatyf lyts, sadat de optimale primerkonsintraasje 250nM is.Yn 't algemien kinne swiere primer-dimers sjoen wurde yn' e smeltkurve.Wat as de ûntworpen primers primer-dimers net kinne foarkomme?
Metoade 3: Ferminderje it bedrach fan primers en fergrutsje de annealing temperatuer (net nedich om te ferklearjen).
De empiryske wearde fan 'e annealing temperatuer is 60 ° C.As jo net wis binne, hoe te selektearjen in mear geskikt annealing temperatuer?It antwurd is itselde as de kar fan primerkonsintraasje -gradient test.Nim in foto fan it bedriuw Bio-rad om it probleem te yllustrearjen.Foar de amplifikaasje fan in bepaald doelfragmint, set acht temperatuergradiënten yn, elk mei trije werhellingen, en de krigen amplifikaasjekromme is as folget:
seleksje fan annealing temperatuer:
· 70 ° C, 69 ° C - Yn prinsipe kinne de primers net kombineare wurde, dus d'r is gjin amplifikaasje.
· 67.3 ° C - Der is in lyts bedrach fan amplification oan it begjin, en de Ct wearde is relatyf grut.
·64.5°C——De Ct-wearde nimt ôf.
· By 60.7 ° C, 58.0 ° C, 56.2 ° C, en 55.0 ° C, de Ct wearden yn prinsipe oanstriid te wêzen stabyl, mar de úteinlike fluorescence wearden wiene oars.
Hoe kieze?Prinsipe: It earste prinsipe is de hegere Ct-wearde.Kies foar deselde Ct-wearde in hegere annealingtemperatuer om dimerisaasje en net-spesifike amplifikaasje te foarkommen.Hoewol't der in hegere fluorescence wearde op 55 ° C, der kin wêze dimers of net-spesifike amplification yn it.
Mar as jo sa tûk binne as jo, sille jo perfoarst tinke: logysk sjoen, as de PCR-reaksje tige spesifyk is, sa lang as de primerkonsintraasje boppe de minimale eask komt, moatte de hege en lege punten gjin effekt hawwe, krekt as fluorescent kleurstoffen en dNTP's.Yndied, salang't de annealingtemperatuer goed is optimalisearre, sil it effekt fan primerkonsintraasje op Ct-wearde natuerlik minimaal wurde.
De annealing temperatuer wurdt optimalisearre goed, en it effekt fan primer konsintraasje op CT sil wurde minimalisearre
Sekundêre struktuer beynfloedet amplification effisjinsje
Litte wy de foto fan Bio-rad nimme om it probleem te yllustrearjen.It ûntwerpt ek in temperatuergradient om in gen te fersterkjen mei in sekundêre struktuer.
Sekundêre struktuer ûntstiet
It kin sjoen wurde dat as de temperatuergradient ôfnimt, produkten begjinne te ferskinen en de Ct-wearde beweecht nei foaren, it berikken fan de minimale wearde op 60,7 ° C, en dan as de temperatuergradient ôfnimt, wurdt de Ct-wearde grutter.Oarsom, as de temperatuer ferheget, iepenet de sekundêre struktuer en nimt de amplifikaasje-effisjinsje ta.Nei it berikken fan in bepaalde temperatuer kin it fergrutsjen fan de temperatuer de amplifikaasje-effisjinsje net ferbetterje.Om't de primers op dit stuit net stabyl kinne wurde kombinearre.Dêrom,sjoch foar de temperatuer mei de leechste Ct wearde, dat is de bêste temperatuer foar it fersterkjen fan de sekundêre struktuer sjabloan!Fansels moatte tûke dwazen witte dat as it net nedich is, it bêste is om de primers te feroarjen en de sekundêre struktuerregio te foarkommen.
5. Applikaasje nivo
MIQE—Data-analyze
De gegevensanalyse wurdt benammen jûn troch it fluorescent kwantitative PCR-ynstrumint.Yn it foarige artikel is in soad data-analyzewurk dien, lykas de blanke kontrôle, dy't útlein is yn it ûntwerp fan it eksperimint.De ynterne referinsjegenen, werhellingsnûmers, ensfh. binne dúdlik wurden., hjir ferklearje wy benammen de tapassing fan qPCR.
qPCR wurdt in protte brûkt, en eksperimintele ferifikaasje en diagnoaze fan nukleïnesûr binne de meast brûkte senario's.
absolute kwantifikaasje
Log (beginkonsintraasje) hat in lineêre relaasje mei it oantal syklusen.In standert kromme kin wurde lutsen út in standert mei bekend initial kopy nûmer, dat is, de lineêre relaasje fan de amplification reaksje kin wurde krigen.Neffens de Ct-wearde fan 'e stekproef kin de konsintraasje yn' e stekproef wurde berekkene.It oantal sjabloanen om op te nimmen.
Absolute kwantitative berekkening metoade
Absolute kwantifikaasje moat wurde basearre op de standert kromme.Om in standert kromme te meitsjen is in standert nedich.Gewoanlik is de standert in plasmide krigen troch it klonearjen fan it doelgen.Wêrom is it in plasmide?Om't sirkulêre plasmide DNA de meast stabile is.Ferwiderje it standertprodukt yn 5 oant 6 gradiënten neffens de ferdûbelingsferhâlding (10-fâldige ferwidering), en betelje omtinken foar de uniformiteit by it ferwetterjen.Lit de Ct wearde falle tusken 15-30.
Standert tarieding
Tagelyk moat it te testen stekproef ek dienlik wurde verdund (ûnthâld de verdunningsfaktor), en de Ct-wearde moat ek falle tusken 15-30.It standertprodukt + it te testen stekproef wurde tegearre op 'e masine pleatst.Nei de run waard in standertkromme makke mei de standertstof, en de te testen samples waarden yn 'e standertkurve brocht om de konsintraasje te berekkenjen.
Hepatitis B-firus HBV-kwantifikaasje is in typyske absolute kwantifikaasje, dy't it firuskopienûmer yn 1ml bloed kin berekkenje.
Berekkening fan kopy nûmer
Sample konsintraasje te testen (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × verdunningsfaktor
Sample molekulêre gewicht = oantal basen × 324
It kopynûmer fan it te testen stekproef (kopyen / ul) = de konsintraasje fan it te testen stekproef / it molekulêre gewicht fan 'e stekproef × 6 × 1014
Berekkening metoade fan kopy nûmer
It boppesteande is de berekkeningsmetoade foar it bepalen fan de kwantiteit.Dit is in wiskundich probleem dat kin wurde oplost nei it ôfstudearjen fan 'e middelbere skoalle, en wiskundige problemen wurde oer it algemien oplost troch kompjûters.As jo net begripe, kinne jo komme om te kommunisearjen.
relative kwantifikaasje
Relative kwantifikaasje wurdt benammen brûkt yn wittenskiplik ûndersyk.Hoefolle firussen binne der yn 1ml bloed, en it is in DNA-firus, dit is in relatyf deterministysk barren: it bedrach fan bloed kin bepaald wurde, en it DNA-firus is relatyf stabyl.It is lykwols lestich foar ús om it oantal transkripsjekopyen fan in bepaald gen yn in blêd te fergelykjen, om't it lestich is om de grutte, gewicht en sêftens fan it blêd te bepalen, de hoemannichte ekstrahearre RNA is dreech te bepalen, en de effisjinsje fan omkearde transkripsje is ek lestich te bepalen, dat wol sizze, elke stap kin meitsje dat de eksperimintele gegevens bugs hawwe en kinne net brûkt wurde.
Dêrom moat relative kwantifikaasje in elemint ynfiere:it ynterne referinsjegen.
Mei oare wurden, relative kwantifikaasje is eins in ferliking tusken it doelgen en it ynterne referinsjegen.Yn ferliking yn itselde weefsel en deselde sel is de ynfloed fan stekproefgrutte, RNA-ekstraksjebedrach, reverse-transkripsje-effisjinsje, en PCR-effektiviteit relatyf lyts.Fanwegen de lytse stekproefgrutte waarden sawol ynterne referinsjegenen as doelgenen relatyf fermindere.Dit is de reden dat wy earder unifoarmens en stabiliteit hawwe beklamme.
Ynterne referinsjegenen binne algemienhousekeeping genen(house-keeping genen), dy't ferwize nei in klasse fan genen dy't stabyl útdrukt yn alle sellen, en harren produkten binne nedich om te behâlden de basis libben aktiviteiten fan sellen.
Ferwarje dit konsept net.Housekeeping-genen binne biologyske funksjebegripen, wylst ynterne referinsjegenen eksperimintele technyske termen binne.Housekeeping-genen moatte validaasje passe foardat se kinne wurde selektearre as ynterne referinsjegenen.
Wy selekteare bygelyks ferskate húshâldingsgenen yn 'e figuer hjirûnder om har ekspresjenivo's te testen yn ferskate weefselsellen, en fûnen dat de ekspresjenivo's fan β-2-microglobulin hiel oars wiene fan dy fan' e oare trije genen, sadat se net koene wurde brûkt as ynterne referinsjegenen.
Nei it begripen fan de korreksjefunksje fan it ynterne referinsjegen, wurde twa algoritmen ôflaat troch de ynfiering fan it ynterne referinsjegen.
· dûbele standert kromme metoade
·2 – △△Ct metoade (CT wearde ferliking metoade)
As jo ynteressearre binne yn in stúdzje soarten en gen funksjes, please opjaan it ûndersyk op algoritmen en brûk formules direkt, of brûk masines direkt;as jo in rjochte man binne yn wiskunde en technyk, fiel jo dan frij.
dûbele standert kromme metoade
Kwantifisearje it doelgen en húshâldingsgen fan 'e kontrôlemonster en it te testen stekproef fia de standertkromme, en berekkenje dan de relative wearde neffens de berekkeningsformule, dat is it relative ekspresjenivo.
Foardielen: ienfâldige analyze, relatyf ienfâldige eksperimintele optimalisaasje
Neidiel: Foar elk gen moat elke ronde fan eksperiminten in standertkromme meitsje
Applikaasje: Ien fan 'e twa meast brûkte en erkende relative kwantitative metoaden yn' e stúdzje fan regeling fan geneekspresje
De formule is as folget:
Foarbylden binne as folget:
Berekkenje it relative bedrach basearre op it kwantitative resultaat
2 - △△Ct metoade (CT wearde ferliking metoade)
Foardielen: Gjin needsaak om in standert kromme te meitsjen
Neidielen: It wurdt oannommen dat de amplification effisjinsje is tichtby 100%;de standertdeviaasje is <5%, en de standertkromme en de effisjinsje tusken elke amplifikaasje wurde oannommen dat se konsekwint binne;it optimalisearjen fan eksperimintele betingsten is komplisearre.
Applikaasje: Ien fan 'e twa meast brûkte en erkende relative kwantitative metoaden yn' e stúdzje fan regeling fan geneekspresje
Fansels is de amplifikaasje-effisjinsje meastal ûnmooglik om perfekt te wêzen. .95–△△Ct
Oant no ta is de ynhâld oer fluorescent kwantitative PCR in ein kommen.
Post tiid: Apr-06-2023
